王 慶，閆靈銳，費小琴，周艷婷

重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司，重慶 401336

鹽酸頭孢替安是諾華制藥和日本武田共同研制開發(fā)的第二代頭孢類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌感染均有效。臨床上不僅用于成人多種感染的治療[1-4]，還用于兒童肺炎[5-6]、腸炎[7]、扁桃體炎[8-9]、猩紅熱的治療[10]及圍術(shù)期感染的預(yù)防[11]。以無水碳酸鈉為輔料的注射用鹽酸頭孢替安原研品，最早于1980年10月在瑞士獲批，并在1981年2月，以商品名Halospor在日本上市。2002年4月，諾華制藥將銷售權(quán)轉(zhuǎn)移給富山化學(xué)。2019年4月，富山化學(xué)開始自行生產(chǎn)和銷售。原研品主要上市國為日本、荷蘭、澳大利亞，目前國內(nèi)尚未進(jìn)口。

注射用鹽酸頭孢替安收載于《美國藥典》43版(USP43)[12]和《日本藥典》17版(JP17)[13]，但均未收載有關(guān)物質(zhì)的檢查項。頭孢類產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)是關(guān)系到產(chǎn)品是否安全有效、不良反應(yīng)多寡，甚至患者生命安全的重要質(zhì)量控制指標(biāo)。國內(nèi)對有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)研究的報道較少。周冉等[14]采用與USP43中含量測定方法相同的等度洗脫高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)進(jìn)行檢測，該方法主峰出峰時間早，能分離的雜質(zhì)有限；王珵等[15]在USP43已有等度洗脫的基礎(chǔ)上，優(yōu)化為梯度沖洗，但是未采用對照品對分離度進(jìn)行驗證，專屬性中未對主峰的純度進(jìn)行檢測；田冶等[16]進(jìn)行了注射用鹽酸頭孢替安中雜質(zhì)的質(zhì)譜定性研究，同時提供了定性的液相條件，但在供試品高溫降解的條件下，降解雜質(zhì)和主峰的分離度較低。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)中報道的注射用鹽酸頭孢替安雜質(zhì)[17-21]，結(jié)合原料藥的合成工藝[22-23]，確定注射用頭孢替安的主要雜質(zhì)為雜質(zhì)A～I(xiàn)，結(jié)構(gòu)式見圖1；并建立了完全分離雜質(zhì)、可穩(wěn)定重復(fù)的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，為控制鹽酸頭孢替安的質(zhì)量提供依據(jù)。

圖1 雜質(zhì)A～I(xiàn)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030C液相色譜儀(帶二級管陣列檢測器，日本島津科技有限公司)；PHS-3W pH計(上海班特儀器制造有限公司)；XS105DU電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；LB-Solution色譜工作站(日本島津科技有限公司)；Eco-S15實驗室純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試藥

鹽酸頭孢替安對照品(批號130565-201703，中國食品藥品檢定研究院)；鹽酸頭孢替安對照品(批號P42-181207G-R-1，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；注射用鹽酸頭孢替安[規(guī)格1.0 g，批號190501(驗證用)，批號05200101Y、05200102Y、05200103Y(檢驗用)，輔料無水碳酸鈉，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司]；雜質(zhì)A(批號M347-181001A-R，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；雜質(zhì)B(批號M410-181001A-R，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；雜質(zhì)C(批號180301，重慶常捷醫(yī)藥有限公司)；雜質(zhì)D(批號P42I1-190301G-R，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；雜質(zhì)E(批號P42I2-180301G-R-1，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；雜質(zhì)F(批號TBTAF2018080101，湖南青純科技有限公司)；雜質(zhì)G(批號P42I3-190701-R，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；雜質(zhì)H(批號20180329，深圳卓越生物科技有限公司)；雜質(zhì)I(批號20190322，深圳卓越生物科技有限公司)；雜質(zhì)J、K混合物(批號P42I4-190701-R，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；乙腈(批號T7QA1H，霍尼韋爾中國有限公司)；磷酸二氫鉀(批號190717，重慶博藝化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(批號2019020101，成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：NanoChrom ChromCore AQ C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。流動相A：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液(用0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.9)；流動相B：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液(用0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.9)-乙腈(80∶20)。梯度程序：按照表1進(jìn)行洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

空白：稀釋劑。雜質(zhì)A、E儲備液：分別取雜質(zhì)A、E對照品適量，加2 mol·L-1鹽酸溶液約1 mL溶解，加稀釋劑稀釋成每1 mL中含雜質(zhì)A、雜質(zhì)E 1 mg的溶液。雜質(zhì)B、C、D儲備液：分別取雜質(zhì)B、C、D對照品適量，加稀釋劑稀釋成每1 mL中含雜質(zhì)B、C、D 1 mg的溶液。系統(tǒng)適用性溶液：取鹽酸頭孢替安對照品適量，加稀釋劑稀釋成每1 mL中含頭孢替安各1 mg的混合溶液。量取系統(tǒng)適用性溶液1 mL與雜質(zhì)A～E儲備液各1 mL，加稀釋劑稀釋成每1 mL中含雜質(zhì)A～E、頭孢替安約10 μg的混合溶液。供試液：精密稱定本品適量，加稀釋劑溶解，制成每1 mL中約含頭孢替安1 mg的溶液(臨用前新制)。對照液：精密量取供試品溶液適量，用稀釋劑稀釋成每1 mL中約含頭孢替安10 μg的溶液。

精密量取空白、供試液、對照液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.3 系統(tǒng)適用性要求

精密量取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。雜質(zhì)B、C、D、A、E和頭孢替安依次出峰，各已知雜質(zhì)之間、各已知雜質(zhì)與頭孢替安峰之間的分離度均不得小于1.5。

注：1.雜質(zhì)B；2.雜質(zhì)C；3.雜質(zhì)D；4.雜質(zhì)A；5.雜質(zhì)E；6.頭孢替安。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1專屬性實驗 雜質(zhì)A～K儲備液：分別取雜質(zhì)A～K對照品適量，溶解后，加稀釋劑稀釋成每1 mL中含雜質(zhì)A～K 1 mg的溶液。混合溶液：取鹽酸頭孢替安對照品適量，加雜質(zhì)儲備液，用稀釋劑稀釋制成每1 mL含各雜質(zhì)10 μg、頭孢替安1 mg的溶液?？瞻纵o料溶液：取處方量無水碳酸鈉，同2.2項下供試品溶液配制方法制備，即得。降解溶液：取供試品適量，分別進(jìn)行光照、酸、堿、氧化和高溫降解，酸、堿降解中和，按2.2項下方法配制供試品溶液。含量測定溶液：分別精密量取上述各種降解有關(guān)物質(zhì)溶液稀釋5倍，進(jìn)行含量測定。取上述溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，輔料不干擾有關(guān)物質(zhì)的檢測。降解條件下，主峰與前、后雜質(zhì)可以有效分離，且峰純度符合要求，物料平衡在《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定的范圍內(nèi)。強制降解結(jié)果還表明，本品易在強酸、強堿、高溫、氧化條件下發(fā)生降解；酸、堿降解的主要產(chǎn)物為雜質(zhì)B、雜質(zhì)E和雜質(zhì)H；氧化降解的主要產(chǎn)物為雜質(zhì)J與雜質(zhì)K；高溫降解的主要產(chǎn)物為雜質(zhì)B、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F。結(jié)果見圖3。

表2 專屬性實驗結(jié)果

注：a.雜質(zhì)混合溶液；b.空白溶液；c.空白輔料溶液；d.未降解溶液；e.光照降解溶液；f.酸降解溶液；g.堿降解溶液；h.氧化降解溶液；i.高溫降解溶液；1.雜質(zhì)B；2.雜質(zhì)C；3.雜質(zhì)D；4.雜質(zhì)A；5.雜質(zhì)J；6.雜質(zhì)H；7.雜質(zhì)K；8.雜質(zhì)E；9.雜質(zhì)F；10.頭孢替安；11.雜質(zhì)I；12.雜質(zhì)G。

2.4.2檢測限與定量限實驗 儲備液：分別取雜質(zhì)A～K、鹽酸頭孢替安對照品適量，加稀釋劑制成每1 mL含雜質(zhì)0.2 mg的溶液；取儲備液適量，逐步稀釋制備檢測限(3倍噪音質(zhì)量濃度)和定量限(10倍噪音質(zhì)量濃度)的實驗溶液，實驗結(jié)果見表3。各雜質(zhì)和頭孢替安的檢測限質(zhì)量濃度低于限度質(zhì)量濃度10%，定量限不超過限度質(zhì)量濃度的30%，符合檢測要求。

2.4.3線性關(guān)系 精密稱取雜質(zhì)A～E及鹽酸頭孢替安對照品適量，稀釋后配制成限度分別為10%、20%、50%、80%、100%、120%、160%的混合溶液。取線性溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并以峰面積為x軸、質(zhì)量濃度為y軸，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，各成分在10%～160%的范圍內(nèi)，將峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計算，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；響應(yīng)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明各組分的線性關(guān)系良好。

表3 檢測限與定量限測定結(jié)果

表4 線性關(guān)系實驗結(jié)果

2.4.4精密度實驗 雜質(zhì)儲備液：分別取雜質(zhì)A～E適量，精密稱定，加稀釋劑配制成每1 mL含雜質(zhì)A～C、雜質(zhì)E 0.2 mg、雜質(zhì)D 0.3 mg的溶液。本底供試液：取鹽酸頭孢替安對照品適量(相當(dāng)于頭孢替安約50 mg)和無水碳酸鈉12.1 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確度50%供試液：取鹽酸頭孢替安對照品適量(相當(dāng)于頭孢替安約50 mg)、無水碳酸鈉12.1 mg，精密稱定，各3份，分別置于3個50 mL量瓶中，精密加入雜質(zhì)儲備液A～E各0.25 mL，雜質(zhì)儲備液B 1.25 mL，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確度100%供試液：精密加入雜質(zhì)儲備液A～E各0.5 mL，其他與50%供試液的制備方法相同。準(zhǔn)確度150%供試液：精密加入雜質(zhì)儲備液A～E各0.75 mL，其他與50%供試液的制備方法相同。

回收率測定結(jié)果見表5。由表5可見，各質(zhì)量濃度下雜質(zhì)A、B、C、D、E的平均回收率分別為98.91%、99.38%、96.36%、97.80%、98.31%，均在90%～108%范圍內(nèi)，且回收率的RSD值分別為3.07%、0.84%、1.70%、2.71%、4.18%，均小于10%，即雜質(zhì)A、B、C、D、E的準(zhǔn)確度符合要求。

表5 回收率實驗結(jié)果

2.4.5重復(fù)性實驗 雜質(zhì)儲備液：按照2.4.4項下雜質(zhì)儲備液的配制方法制備。取注射用鹽酸頭孢替安，按照2.4.4項下準(zhǔn)確度100%供試液的配制方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣分析，計算已知雜質(zhì)RSD值及總雜質(zhì)RSD值。測得數(shù)據(jù)均符合要求，RSD值(n=6)均小于10%，說明該方法的重復(fù)性較好。

2.4.6中間精密度 按照2.4.3項下準(zhǔn)確度100%供試液的配制方法制備供試品溶液6份，不同時間、不同儀器、不同人員進(jìn)行實驗，測得數(shù)據(jù)均符合要求，RSD值(n=6、n=12)均小于10%，結(jié)果見表6，說明該方法的中間精密度較好。

表6 重復(fù)性與中間精密度實驗結(jié)果

2.4.7溶液穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液適量，置于2個進(jìn)樣小瓶，分別于室溫和4 ℃放置，于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣檢測，結(jié)果顯示室溫溶液在2 h時總雜質(zhì)相比0 h大1.1%；4 ℃放置，8 h時總雜質(zhì)增加0.17%，2 h總雜質(zhì)增加0.077%，表明該溶液在室溫下不穩(wěn)定，在4 ℃條件下放置2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.8耐用性考察 考察不同條件(pH±0.1、波長±2 nm、柱溫±2 ℃、磷酸鹽濃度±0.005 mol·L-1、流速±5%、不同批次色譜柱)下，系統(tǒng)適用性及樣品檢測結(jié)果。結(jié)果表明，在上述條件下系統(tǒng)分離度合格，測得本品雜質(zhì)A～E的含量及總雜質(zhì)與擬用條件的絕對差值均在±0.1%范圍內(nèi)，表明該方法的耐用性良好。

2.4.9樣品測定 檢測注射用鹽酸頭孢替安3批，批號分別為05200101Y、05200102Y、05200103Y(1.0 g)，結(jié)果見表7。

3 討論

3.1 檢測波長的確定

本品USP43和JP17均未收載有關(guān)物質(zhì)，2個標(biāo)準(zhǔn)含量項目的檢測波長均為254 nm。通過檢測各有關(guān)物質(zhì)的紫外吸收波長，多數(shù)有關(guān)物質(zhì)峰與主峰在254 nm處有明顯且相似的吸收，故選擇254 nm作為檢測波長。

表7 樣品測定結(jié)果

3.2 pH的選擇

考察了不同pH(4.2、4.9、5.6)流動相的分離效果，各雜質(zhì)與頭孢替安的出峰時間均隨pH升高而延后；pH升高，雜質(zhì)K與雜質(zhì)H、雜質(zhì)E與雜質(zhì)F分離度上升，但雜質(zhì)H與雜質(zhì)J、雜質(zhì)G與雜質(zhì)I分離度會下降，根據(jù)主成分與雜質(zhì)混合溶液色譜圖，在pH4.9時分離度整體較好，在pH5.6時出峰時間太晚，因此選擇流動相pH為4.9。

3.3 柱溫的選擇

考察了不同柱溫(30、35、40 ℃)流動相的分離效果，升高柱溫，有利于雜質(zhì)H與雜質(zhì)K、雜質(zhì)I與頭孢替安的分離。柱溫在40 ℃時，各雜質(zhì)的分離度良好，因此最終確定柱溫為40 ℃。

4 結(jié)語

雜質(zhì)A、C、D為工藝雜質(zhì)在產(chǎn)品中殘留的可能性大，雜質(zhì)B、E為主要降解雜質(zhì)，因此，本研究將雜質(zhì)A、B、C、D、E作為主要已知雜質(zhì)，采用以系統(tǒng)溶液進(jìn)行定位，加校正因子的自身對照法進(jìn)行控制；對于雜質(zhì)F～K，采用不加校正因子的自身對照法進(jìn)行控制。經(jīng)過對波長、pH、柱溫、梯度程序等條件的優(yōu)化，本研究建立了一種專屬性、準(zhǔn)確性、耐用性均較好的方法。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法適用于注射用鹽酸頭孢替安雜質(zhì)含量的檢測與控制。