沈嚴(yán)嚴(yán)，文 南，湯 盼

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院超聲科，湖南 衡陽(yáng) 421002；2.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421000）

乳腺癌（breast cancer）是除東非地區(qū)外，女性患者最常罹患的惡性腫瘤，也是全球11 個(gè)地區(qū)中因惡性疾病致死的最常見(jiàn)原因[1]?，F(xiàn)如今乳腺癌的治療方法主要有放療、新輔助化療、手術(shù)切除、靶向生物治療等方式，但存在晚期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，以及化療藥物耐藥，給臨床治療帶來(lái)了巨大困難[2]。因此，需要深入研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制，尋找治療乳腺癌的新通路、新靶點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）通過(guò)與目標(biāo)基因mRNA 互補(bǔ)結(jié)合負(fù)性調(diào)控mRNA 的穩(wěn)定性或遏制其翻譯效率從而調(diào)控生命活動(dòng)，是一串內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其在乳腺癌中的致病作用機(jī)制的研究中已成為一大熱點(diǎn)[3]。miR-622 近來(lái)被廣泛報(bào)道是miRNA 家族中的主要成員，在多項(xiàng)研究中顯示miR-622 可調(diào)控癌癥相關(guān)通路抑制癌癥發(fā)展，是癌癥的抑制因子[4，5]。研究顯示[4-6]，miR-622 在胃癌、乳腺癌等癌癥中作用異常，而miR-622 在乳腺癌中起致癌還是抑癌作用仍存在爭(zhēng)議。miRNA 在腫瘤中的作用機(jī)制通常與多種蛋白有關(guān)[7]。Wang X等[8]報(bào)道顯示，miR-622 抑制K-Ras 的表達(dá)起抑癌作用。而生物信息學(xué)研究顯示miR-622 也與EYA1有預(yù)測(cè)的可能結(jié)合位點(diǎn)。miR-622 與EYA1 在癌癥中作用關(guān)系的研究尚不清楚，EYA1 是兼具有轉(zhuǎn)錄活性與磷酸酶活性的轉(zhuǎn)錄因子，最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控眼睛形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究采用qRT-PCR 檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 中miR-622 的表達(dá)情況，通過(guò)miR-622 inhibitor 抑制miR-622 的表達(dá)后觀察癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化，以及乳腺癌細(xì)胞中EYA1 的表達(dá)情況，探討miR-622 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 從南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究所獲取；雙抗、胎牛血清、胰酶、DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；RIPA 細(xì)胞裂解液（上海雅吉生物科技有限公司）；Western blot試劑盒、BCA 試劑盒、HE 染色試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；GAPDH 一抗、EYA1 一抗、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（美國(guó)ABclonal 公司）；CCK-8 試劑盒、ECL 高效化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Genview 公司）；PVDF 膜（美國(guó)GE 公司）；預(yù)染蛋白marker（上海百賽生物科技有限公司）；通用型microRNA 提取試劑盒（北京金百特生物技術(shù)有限公司）；miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；DEPC 水（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；miR-NC、miR-622 inhibitor、Ribofactamine 試劑盒（廣州銳博生物技術(shù)有限公司）；Matrigel（美國(guó)BD公司Becton，Dickinson and Company）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌MCF-7 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)30%～50%時(shí)，根據(jù)制造商提供的說(shuō)明，使用Ribofactamine 轉(zhuǎn)染試劑將miR-622 inhibitor、miR-NC 轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中。設(shè)為miR-622 inhibitor 組、miR-NC 組，另設(shè)control 組。將細(xì)胞放到37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～36 h 后，利用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)miR-622 的表達(dá)情況，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 RNA 提取與qRT-PCR 檢測(cè) 根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞系中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成特異性miRNA-622 引物和U6 內(nèi)參引物。使用qRT-PCR 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃10 s；95 ℃5 s，40×；溶解曲線程序：95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s。完成定量后進(jìn)行相對(duì)定量分析（2-△△Ct），得出miRNA-622 相對(duì)表達(dá)量。所有反應(yīng)均進(jìn)行3 次。

1.2.3 細(xì)胞增殖 根據(jù)說(shuō)明用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。轉(zhuǎn)染后，收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7 細(xì)胞，并以每孔5.0×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到96 孔板上，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 和72 h 后，分別用20 μl CCK-8 試劑處理細(xì)胞，并在37 ℃條件下孵育2 h。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的OD 值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞遷移 通過(guò)進(jìn)行傷口愈合試驗(yàn)來(lái)評(píng)估細(xì)胞遷移能力。轉(zhuǎn)染48 h 后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7 細(xì)胞接種到6 孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度至80%～90%時(shí)，使用無(wú)菌的10 μl移液管尖端在每個(gè)孔的中心處劃傷。細(xì)胞劃傷后用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）洗去脫落的細(xì)胞，將剩余的細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)12 h。在0 h 和12 h 分別用顯微鏡拍攝照片。對(duì)于每個(gè)圖像，劃痕兩側(cè)之間的距離使用ImageJ 軟件進(jìn)行測(cè)量。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3 次。

1.2.5 細(xì)胞侵襲 根據(jù)制造商的說(shuō)明，在Transwell 小室（Becton，Dickinson and Company，USA）中評(píng)估MCF-7 細(xì)胞侵襲能力。將Matrigel 預(yù)先包被在Transwell 上室，然后將轉(zhuǎn)染48 h 后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，按照1×104細(xì)胞/孔的量接種在Matrigel 上。向下室中加入含有20%FBS培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕拭去上室的細(xì)胞和多余Matrigel 膠，4%甲醛固定10 min，PBS 清洗3 次后，根據(jù)HE 染色試劑盒染色。PBS 清洗后隨機(jī)選取5 個(gè)顯微鏡下視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 EYA1 蛋白檢測(cè) 采用Western blot 試劑盒檢測(cè)EYA1 蛋白表達(dá)水平。收集各組細(xì)胞，RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品進(jìn)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉(zhuǎn)PVDF 膜。封閉液封閉2 h 后，加入一抗EYA1（1∶5000 稀釋）或GAPDH（1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5000 稀釋），室溫孵育1 h。用ECL 高效化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)條帶，采用ImageJ 凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 21.0 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-622 inhibitor 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-622 表達(dá)水平及細(xì)胞增殖情況 miR-622 inhibitor 組中miR-622 相對(duì)表達(dá)量為（0.53±0.07），低于control 組的（1.05±0.06）及miR-NC 組的（1.03±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1；CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12 h 后，miR-622 inhibitor 組（0.41±0.23）增殖能力低于control 組（0.58±0.33）及miR-NC 組（0.55±0.31），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 各組細(xì)胞中miRNA-622 的表達(dá)情況

圖2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞中的增殖能力

2.2 miR-622 inhibitor 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移情況 miR-622 inhibitor 組遷移率（21.31±6.91）%低于control組（39.89±9.32）%及miR-NC 組（32.47±7.82）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)測(cè)定各組乳腺癌細(xì)胞中的遷移能力

2.3 miR-622 inhibitor 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲情況 control組（160.33±11.93）及miR-NC 組（160.33±11.02）侵襲細(xì)胞數(shù)高于miR-622 inhibitor 組的（125.00±11.53），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組中乳腺癌細(xì)胞中的侵襲能力情況

2.4 miR-622 inhibitor 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EYA1 表達(dá)水平 Western blot 研究結(jié)論顯示，miR-622 inhibitor組細(xì)胞EYA1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平為（3.77±0.27），高于control 組的（1.04±0.04）和miR-NC 組的（0.97±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示miR-622可能調(diào)控EYA1 的表達(dá)，其中miR-622 呈負(fù)向調(diào)控，見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot 檢測(cè)各組EYA1 蛋白的表達(dá)水平

3 討論

乳腺癌是全世界女性因癌癥致死的最常見(jiàn)原因，對(duì)乳腺癌的診療技術(shù)的探討仍是一大熱點(diǎn)。雖然目前通過(guò)手術(shù)切除、新輔助化療、放療、中醫(yī)和靶向治療等綜合方法，乳腺癌的發(fā)展得到一定緩解，但5 年總生存率仍然較低[1]。因此迫切需要了解乳腺癌的分子發(fā)病機(jī)制，從分子水平探討治療乳腺癌的可能性以及開(kāi)發(fā)用于靶向治療藥物，對(duì)乳腺癌進(jìn)行精準(zhǔn)治療，提高患者生存率。miRNA 對(duì)腫瘤的調(diào)控作用越來(lái)越受到重視[7]。既往研究表明[8，9]，miRNA 影響了癌細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移與侵襲，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

miRNA 與靶基因信使RNA（mRNA）結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)mRNA，從而影響生命活動(dòng)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。既往研究顯示[10]，miR-622 位于人染色體13q31.3 區(qū)域，在多種腫瘤中異常表達(dá)，靶向調(diào)節(jié)不同信號(hào)通路在多種癌癥中發(fā)揮作用。但有關(guān)miR-622 在乳腺癌中的參與機(jī)理的研究甚少。本研究采用了在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-622 inhibitor 下調(diào)癌細(xì)胞中miR-622 后發(fā)現(xiàn)，與control 組以及miRNC 組比較，miR-622 inhibitor 組中癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲力均顯著減弱這一現(xiàn)象，并由此證明了miR-622 的表達(dá)可以參與乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，抑制miR-622 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲從而參與了抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。此研究中提示miR-622 在乳腺癌的增殖、遷移和侵襲中起促進(jìn)作用。魏晰麟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中miR-622 表達(dá)是升高的，促進(jìn)miR-622 的表達(dá)水平后可下調(diào)DYRK2 表達(dá)并使得SW1116 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用增強(qiáng)。李仲均等[11]研究顯示，miR-622 在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)增高可能發(fā)揮促癌作用。說(shuō)明miR-622 確實(shí)可通過(guò)影響某些通路而促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移與發(fā)展，產(chǎn)生促癌作用。然而有研究結(jié)果顯示miR-622 的表達(dá)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌等癌癥中上調(diào)。Wang X 等[8]的研究，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展中，增高的miR-622 抑制K-Ras 的表達(dá)從而發(fā)揮了遏制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。通過(guò)靶向調(diào)節(jié)c-Myc，miR-622過(guò)度表達(dá)抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-622 則產(chǎn)生相反的結(jié)果[9]。上述研究中提示上調(diào)miR-622 可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而抑制miR-622 可減弱這一作用。Orlandella FM 等[4]及Liu C 等[5]的研究顯示，高表達(dá)miR-622 抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果與上述研究存在差異，可能通過(guò)不同的信號(hào)通路以及與不同的分子協(xié)作或拮抗發(fā)揮不同的作用有關(guān)。miR-622 家族對(duì)促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用方面的研究存在不同意見(jiàn)。

為了進(jìn)一步研究miR-622 調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的機(jī)制，本研究根據(jù)生物信息學(xué)，尋找到EYA1 基因與miR-622 具有結(jié)合位點(diǎn)，用Western blot 檢測(cè)了miR-622 inhibitor 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EYA1 表達(dá)水平，試圖尋找EYA1 基因與miR-622 存在關(guān)聯(lián)的證據(jù)。EYA1 即“果蠅眼缺失”基因，是與果蠅眼睛形態(tài)發(fā)育有關(guān)的重要調(diào)控因子[12]。在人類身上，EYA 基因家族的缺失或突變，會(huì)造成一種常染色體顯性遺傳性疾病，即鰓-耳-腎綜合征，該病以腎臟發(fā)育異?；蛉笔?、鰓裂發(fā)育異常、耳前瘺管以及聽(tīng)力損失為特征[13-15]。近年來(lái)，有關(guān)EYA1 在各種腫瘤惡性進(jìn)展中的作用機(jī)制的研究得到大量關(guān)注。然而有關(guān)EYA1 在乳腺癌中的作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，本研究在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-622 抑制物后發(fā)現(xiàn)EYA1 表達(dá)增高，說(shuō)明抑制miR-622 表達(dá)可上調(diào)EYA1 的水平，結(jié)果提示miR-622 可能負(fù)調(diào)控EYA1 的表達(dá)。在本研究中，抑制miR-622 表達(dá)可能對(duì)癌細(xì)胞增殖起削弱作用，同時(shí)EYA1 的表達(dá)水平升高，實(shí)驗(yàn)提示miR-622 水平降低有可能通過(guò)調(diào)控EYA1 來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。在本研究中，EYA1 可能起抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用，而在某些研究中EYA1 卻扮演著促癌基因的角色。Kong D 等[16]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中，EYA1與侵襲性以及不良預(yù)后有明顯的關(guān)聯(lián)，研究顯示在肝細(xì)胞癌中EYA1 的表達(dá)提高，并且可使得肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用加強(qiáng)。Cai S 等[17]探究結(jié)直腸癌中的發(fā)病機(jī)理時(shí)，發(fā)現(xiàn)EYA1 表達(dá)水平增高可誘導(dǎo)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。且Guan H 等[18]的研究探討了EYA1 在乳腺癌中的作用，結(jié)果提示靶向下調(diào)EYA1 減弱了乳腺癌細(xì)胞的增殖作用。在癌癥發(fā)生機(jī)制中，一般存在多種因素相互作用產(chǎn)生抑癌或促癌效果，EYA1 在乳腺癌中的具體作用仍是需要研究的方向，目前尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明miR-622 是否與EYA1 存在結(jié)合位點(diǎn)，且miR-622 下調(diào)EYA1 是否在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮效果以及可能存在的具體信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，上述研究提示抑制miR-622 的表達(dá)后可抑制乳腺癌的增殖、侵襲與遷移，抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，miR-622 是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，為乳腺癌基因治療提供了新的靶點(diǎn)并且可作為靶向藥物開(kāi)發(fā)的新方向，促進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)治療。并且miR-622 可能負(fù)調(diào)控EYA1 發(fā)揮作用，然而miR-622 調(diào)控EYA1 的機(jī)制以及上下游通路仍有待進(jìn)一步探索，為以后有關(guān)乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究提供了新思路。