謝明輝，喬韡華，曹 紅，史嘉瑋，董念國

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)發(fā)病率約占新生兒的1%，是1歲以下嬰兒死亡的主要原因之一[1]，主要表現(xiàn)為多種心臟結(jié)構(gòu)發(fā)育的異常。除了遺傳因素，心臟毒性藥物和血流動力等非遺傳因素也可通過調(diào)節(jié)基因表達來調(diào)控心臟的發(fā)育與成熟。血液的流動可產(chǎn)生多種機械力，包括血壓施加在血管壁上的法向力、血管因法向力而伸展產(chǎn)生的相關(guān)周向應(yīng)力以及血液沿著血管壁流動時的摩擦力(也稱剪切應(yīng)力)[2]。與其他血管內(nèi)皮細胞相比，心內(nèi)膜細胞還接收除血流動力以外的其他生物物理力和機械應(yīng)力，包括心臟舒張期的拉伸和收縮期的緊縮[3]。研究表明，血液的機械信號可誘導(dǎo)細胞水平上的基因表達，將分子水平事件的發(fā)生轉(zhuǎn)化為組織水平的結(jié)構(gòu)改變，進而引導(dǎo)胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育與成熟[4- 6]。

力學(xué)刺激對心臟發(fā)育的調(diào)節(jié)

心臟形態(tài)發(fā)育過程在不同物種之間略有區(qū)別，但通常包括心管形成、心袢形成、心內(nèi)膜墊及瓣膜、間隔形態(tài)發(fā)生、心室發(fā)育與成熟等階段。心臟發(fā)育涉及復(fù)雜的組織形態(tài)發(fā)生和重塑，其中力學(xué)刺激發(fā)揮著重要作用(圖1)。

心管形成在心臟發(fā)育早期，兩側(cè)分離的心源性中胚層間充質(zhì)細胞遷移至腹中線并形成中空管狀結(jié)構(gòu)，即原始心管。心管由外層心肌細胞層和內(nèi)層心內(nèi)膜細胞層組成，兩者之間隔有含膠樣結(jié)締組織的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)[7]。由ECM纖維連接蛋白構(gòu)成的力學(xué)微環(huán)境和細胞黏附是心臟早期重要的機械刺激[8]。通過對纖維連接蛋白和中胚層細胞追蹤成像發(fā)現(xiàn)，組織間的對流運動顯著影響早期細胞遷移[9- 10]。Holtzman等[9]和Aleksandrova等[11]發(fā)現(xiàn)心臟融合包括內(nèi)側(cè)運動和角運動兩種定向細胞運動，這一過程可能受到心內(nèi)膜細胞及纖維連接蛋白的調(diào)控。心管形成過程中，心肌前體細胞與其周圍ECM作為組織復(fù)合體一起遷移，稱為組織運動。體內(nèi)動態(tài)成像和計算機模擬證明心肌組織通過組織運動定向遷移到腹中線[12]，內(nèi)胚層的匯聚融合及心肌組織的收縮彎曲在其中發(fā)揮重要作用[13- 14]，并受鞘氨醇- 1-磷酸及血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等信號通路的調(diào)節(jié)[15- 16]。許多先天性心臟缺陷如Cornelia de Lange綜合征表現(xiàn)為內(nèi)胚層缺陷[17]，因此了解內(nèi)胚層和心臟中胚層之間的力學(xué)相互作用有助于闡明此類疾病的發(fā)病機制。

心袢形成心管呈不對稱生長，彎曲扭轉(zhuǎn)呈“S”形的過程稱心袢形成。心袢形成的可能機制包括心臟膠質(zhì)的擴張、心管的差異生長以及由于殘余應(yīng)力導(dǎo)致的心肌背側(cè)系膜縮短[7- 8，18]。但這些假設(shè)與現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)并非完全吻合，可能是因為受到其他補償機制的影響。目前已有多種實驗方法來量化心袢階段心臟內(nèi)的應(yīng)力和應(yīng)變[19- 21]，包括“C”形心袢(右袢)階段和“S”形心袢階段。在心臟發(fā)育的右袢階段，離體心管可以彎曲而不能扭轉(zhuǎn)[22]，表明右袢的彎曲主要受細胞內(nèi)力影響，而扭轉(zhuǎn)主要是由細胞內(nèi)力和鄰近組織外力共同驅(qū)動[23]，即細胞骨架的收縮、肌動蛋白聚合驅(qū)動的心肌細胞形變和ECM微力學(xué)刺激等[24- 25]。

心內(nèi)膜墊及瓣膜、間隔形態(tài)發(fā)生在“S”形心袢成熟過程中，單管心管逐漸轉(zhuǎn)化為2個平行的體循環(huán)和肺循環(huán)通道。房室管(atrioventricular canal，AVC)和流出道(outflow tract，OFT)部位的心肌細胞分泌ECN沉積在心臟膠質(zhì)部，形成AVC和OFT心內(nèi)膜墊。心內(nèi)膜墊間充質(zhì)來源于內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT)的心內(nèi)膜細胞，神經(jīng)嵴細胞也參與OFT心內(nèi)膜墊間質(zhì)細胞的形成，該過程受到骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號及ECM的調(diào)節(jié)作用[26- 27]。在瓣膜形成前，心房、AVC和心室的協(xié)調(diào)收縮發(fā)揮原始瓣膜作用，并驅(qū)動形成原始心管的單向血流。但AVC處仍存在逆向血流，其產(chǎn)生的剪切應(yīng)力被心內(nèi)膜細胞感知后，可誘導(dǎo)流動反應(yīng)基因Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(Krüppel-like transcription factor 2，KLF2)的表達，促進心內(nèi)膜墊的發(fā)育進程[28]。

圖1 心臟發(fā)育的力學(xué)調(diào)節(jié)

心內(nèi)膜墊經(jīng)過生長和重塑，形成成熟心臟的瓣膜及膜性間隔，其中瓣膜細胞異質(zhì)性和血流動力學(xué)在瓣膜形成過程中發(fā)揮重要作用[29- 30]。在人體中，血液振蕩流動和逆向流動通?？纱龠M動脈粥樣硬化和炎癥形成[31]，但在斑馬魚AVC處的振蕩流動卻有助于瓣膜形成[32- 33]。振蕩流動激活心內(nèi)膜細胞表面機械敏感鈣離子通道多囊腎病2型致病基因(polycystic kidney disease gene 2，PKD2)和瞬時受體電位香草素亞型4(transient receptor potential vanilloid subtype 4，TRPV4)，可誘導(dǎo)KLF2的表達，從而促進瓣膜的早期形成，而PKD2和TRPV4等位基因功能缺陷的斑馬魚胚胎發(fā)育形成了異常形態(tài)的瓣膜。內(nèi)皮細胞的體外實驗表明，血流動力學(xué)諧波頻率(hemodynamic frequency harmonics，HFH)構(gòu)成內(nèi)皮炎癥表型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[34]。HFH(尤其一次諧波)可通過PKD2和TRPV4通道的激活直接影響瓣膜形成和心內(nèi)膜細胞反應(yīng)[33]。血流動力的變化還可導(dǎo)致微小RNA(microRNA，miRNA)的表達改變，進而調(diào)節(jié)心血管的結(jié)構(gòu)發(fā)育。比如miR- 21可被血液流動誘導(dǎo)表達，進而促進瓣膜祖細胞的增殖[35- 36]。此外，活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell，NFAT)/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、Hippo-Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)和Notch信號通路參與響應(yīng)機械力的瓣膜形態(tài)發(fā)生[37- 39]，并受到Piezo和瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)等機械敏感通道調(diào)節(jié)[40]。因此，瓣膜發(fā)育過程依賴于多種血流相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及信號通路的激活，但仍需要進行更多的研究明確瓣膜的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。此外，關(guān)于靜脈瓣的研究可能有助于發(fā)現(xiàn)心臟瓣膜相關(guān)的新的力學(xué)調(diào)節(jié)機制。

早期學(xué)者認為血流有助于心臟膠質(zhì)和小梁共同形成分隔心腔的隔膜[41]，其調(diào)節(jié)作用可能來自胚胎早期心臟內(nèi)的兩支螺旋流。由于心內(nèi)壓力梯度的存在，兩支螺旋流之間可能形成早期心臟間隔[41]。卵黃靜脈結(jié)扎可干擾胚胎心臟血流動力學(xué)，進而抑制心室間隔和瓣膜發(fā)育[42]。雖然“血流重塑”假說仍有爭議，但現(xiàn)有實驗證明胚胎心臟血流動力學(xué)的改變可以誘發(fā)多種心臟間隔發(fā)育畸形[14，43- 44]，其中最常見的畸形是室間隔缺損。

心室發(fā)育與成熟血流是一種外力，可促進心室細胞的增殖，而心肌的收縮力是一種內(nèi)力，限制心室細胞自身的大小。在漢堡漢密爾頓階段(Hamburger-Hamilton stages，HH)23～30期，AVC處的高速血流在心室腔內(nèi)形成明顯的渦流。渦流出現(xiàn)的時間較心室腔發(fā)育擴張更早，而渦流大小與心室腔擴張程度相關(guān)，表明渦流的形成可能影響心室成熟[45]。同時，循環(huán)血壓在小梁和致密心肌間產(chǎn)生周向應(yīng)變梯度，可調(diào)節(jié)心肌細胞的增殖以及相關(guān)基因表達，從而促進心室發(fā)育[46]。此外，小梁處的剪切應(yīng)力較高，經(jīng)機械轉(zhuǎn)導(dǎo)后促進心肌增殖成熟，從而促進心室的發(fā)育[47]。發(fā)育中的心室腔增加的壁張力或應(yīng)力反過來也可促進小梁發(fā)育[48]。

隨著胚胎心臟發(fā)育，循環(huán)血流形成的前負荷增加，可促進心室的擴張與成熟。左房結(jié)扎術(shù)是右心室前負荷增加和左心室前負荷降低的模型，術(shù)后可導(dǎo)致左側(cè)AVC和共同心室左側(cè)的壁應(yīng)力水平下降[49- 50]，出現(xiàn)左室心肌細胞增殖減少而右側(cè)心肌代償性過度發(fā)育的病理特征。在此基礎(chǔ)上，部分夾閉右心房會增加流向左心室的血流量，導(dǎo)致基于心肌細胞增殖的左心室容積及心肌致密度的增加[51]。由于右心室的可塑性較左心室高，單純的右房結(jié)扎處理不會導(dǎo)致類似左房結(jié)扎術(shù)后的嚴重形態(tài)缺陷[42]。OFT部分結(jié)扎處理后，該區(qū)域血流速度和室壁運動增加，術(shù)后狹窄處血流及后負荷增加能為心肌細胞的生長提供更多能量[52]。而病理性O(shè)FT梗阻可導(dǎo)致心室發(fā)育不良，梗阻解除后可一定程度上改善心室發(fā)育[53]。此外，有學(xué)者利用4D薄片成像技術(shù)研究心內(nèi)膜運動。通過注射GATA結(jié)合蛋白- 1a(GATA binding protein 1a，GATA- 1a)嗎啉低聚物抑制造血，從而降低血液黏度和剪切應(yīng)力，最終導(dǎo)致心肌發(fā)育受抑制[54]。此外，收縮受抑制的弱心房m58突變體可產(chǎn)生心室高度發(fā)育不全的先天性畸形[54- 55]。雖然尚不清楚確切的力學(xué)作用機制，但在血流動力學(xué)紊亂的情況下，小梁及心肌發(fā)育的缺陷表明血流動力學(xué)在調(diào)節(jié)心室發(fā)育方面的重要性。

心內(nèi)膜細胞的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

將機械刺激轉(zhuǎn)化為細胞信號的過程稱為機械轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括誘導(dǎo)、早期適應(yīng)反應(yīng)和晚期重塑反應(yīng)3個階段[56]。內(nèi)皮細胞表達多種機械感受器，包括離子通道、整合素、受體酪氨酸激酶、糖萼、初生纖毛、微囊、異三聚體G蛋白、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1)和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin)等[57- 58]。這些機械感受器通過機械轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞血流相關(guān)信號，并通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和Notch等下游信號通路引發(fā)調(diào)控反應(yīng)[59- 60](圖2)。與其他內(nèi)皮組織類似，心內(nèi)膜細胞對血流刺激非常敏感。血流刺激介導(dǎo)機械敏感的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而引起心內(nèi)膜細胞的形態(tài)及排列方向的變化，最終導(dǎo)致胚胎心臟對血流環(huán)境的形態(tài)及功能適應(yīng)[59]。

PECAM1-VE-cadherin-VEGFR2復(fù)合物PECAM1、VE-cadherin和血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物可介導(dǎo)對血流的多重反應(yīng)[61]。VEGFR2以不依賴配體的方式被血流激活[62]，激活后VEGFR2募集并激活胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)，PI3K介導(dǎo)關(guān)鍵的下游信號[63]，包括蛋白激酶B依賴的內(nèi)皮型一氧化氮合酶的磷酸化[64]以及基底面整合素的構(gòu)象激活[65]。整合素隨后結(jié)合基底面的ECM，進而活化其鄰近細胞的多種信號通路蛋白，包括Rho和Rac。Rho和Rac蛋白被激活后，引起內(nèi)皮細胞的細胞骨架發(fā)生重構(gòu)，進而發(fā)生細胞形變、拉伸以及細胞排列方向的改變以適應(yīng)血流刺激[66- 67]。瓣膜內(nèi)皮細胞排列依賴于Rho激酶信號通路，而血管內(nèi)皮細胞排列依賴于Rho激酶和PI3K信號通路，從而導(dǎo)致2種細胞排列方向的差異性[68- 69]。

PECAM1：血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1；VE-cadherin：血管內(nèi)皮鈣黏蛋白；VEGFR2：血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2；GPCRs：G蛋白偶聯(lián)受體；RTK：受體酪氨酸激酶；AC：腺苷酸環(huán)化酶；PLC：磷脂酶C；FAK：黏著斑激酶；ATP：三磷酸腺苷；cAMP：環(huán)磷酸腺苷；PIP2：磷脂酰肌醇二磷酸；PIP3：磷脂酰肌醇三磷酸；IP3：三磷酸肌醇；DAG：二酰基甘油；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；PKA：蛋白激酶A；PKB：蛋白激酶B；PKC：蛋白激酶C；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶

然而，PECAM1基因敲除的小鼠能夠存活到成年，且只有輕微的心血管缺陷[70]，表明內(nèi)皮細胞相關(guān)的機械敏感通路在心血管發(fā)育過程中的作用不是唯一的，存在遺傳補償或多個通路的功能代償。此外，VE-cadherin的敲除會導(dǎo)致心袢異常和心內(nèi)膜細胞連接缺陷，并增加心內(nèi)膜通透性[71]。但該研究未證明這些缺陷是由機械傳導(dǎo)能力改變所致還是內(nèi)皮細胞黏附功能改變所致。

初級纖毛隨著心內(nèi)膜的發(fā)育，初級纖毛維持在低血流或湍流處的內(nèi)皮細胞表面，而在心內(nèi)膜墊等高血流區(qū)域則無纖毛，這可能是與高剪切應(yīng)力有關(guān)[72]。剪切應(yīng)力刺激無纖毛表達的心內(nèi)膜細胞后，可介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β受體1(transforming growth factor-β receptor I，TGF-βR1)依賴的EndoMT過程，從而促進早期瓣膜的形成[73- 75]。內(nèi)皮細胞的纖毛可能在感知低速血流中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表達低水平KLF2，可通過Notch1信號介導(dǎo)鄰近心肌細胞的增殖和分化[59，76- 77]。初級纖毛的空間分布差異，可能導(dǎo)致不同區(qū)域心內(nèi)膜細胞對血流刺激的反應(yīng)不同，而纖毛功能失調(diào)可導(dǎo)致房、室間隔發(fā)育缺陷等CHD的發(fā)生[78]。

離子通道血流可調(diào)節(jié)細胞膜流動性或張力的變化，通過激活細胞表面的離子通道，向胞內(nèi)傳遞血流信號。文獻報道在斑馬魚瓣膜形成過程中，纖毛與鈣離子通道偶聯(lián)傳遞剪切應(yīng)力信號[72]。Piezo蛋白是一類機械激活的離子通道，可介導(dǎo)心內(nèi)膜對血流的反應(yīng)[79- 80]。其中，心內(nèi)膜細胞表面的Piezo1通道由剪切應(yīng)力激活[81]，在AVC和OFT處表達水平最高，Piezo1缺失會導(dǎo)致細胞排列方向紊亂、血管發(fā)育缺陷甚至早期胚胎死亡[81- 82]。此外，PKD2和TRPV4能感知AVC區(qū)域的振蕩血流，通過調(diào)節(jié)Ca2+水平和KLF2a的表達，影響瓣膜形成和心內(nèi)膜細胞反應(yīng)[33]。

總之，血流等力學(xué)刺激激活心內(nèi)膜細胞表面的機械傳感器后，力學(xué)刺激從細胞膜傳遞到細胞骨架，后者與核支架、染色質(zhì)和核DNA相連，最終引起基因表達改變。

心肌細胞的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

具有收縮特性的心肌細胞能直接感受到血流刺激，并影響血流模式[83]。在心臟形態(tài)發(fā)育階段，心肌細胞通過改變其形態(tài)及增殖率來響應(yīng)血流機械刺激[46，60]。附著在肌球蛋白細胞骨架上的機械傳感器能夠傳遞細胞間、細胞內(nèi)和細胞外的機械刺激。例如，在細胞-ECM界面，整合素以肌原蛋白附著點和黏著斑為機械傳感器；而在細胞-細胞連接處，相鄰心肌細胞則通過閏盤上的N-鈣黏蛋白黏附復(fù)合物傳遞機械力[84- 86]。

血流剪切應(yīng)力、拉伸力和ECM等力學(xué)刺激共同參與心肌細胞的多個機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使發(fā)育中的心臟適應(yīng)不斷變化的血流動力學(xué)環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP通路參與心內(nèi)膜細胞增殖及EndoMT、心臟成纖維細胞分化、冠狀動脈發(fā)育等過程，該通路在調(diào)節(jié)心肌細胞增殖和分化、應(yīng)激反應(yīng)和機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[87- 89]。ECM相關(guān)的力學(xué)微環(huán)境的改變可激活Hippo-YAP通路，進而調(diào)節(jié)心肌細胞增殖和凋亡，最終影響心臟發(fā)育和再生過程[90- 91]。局部拉伸等機械信號可導(dǎo)致細胞骨架重塑和YAP的激活[92- 93]，激活的YAP通過與轉(zhuǎn)錄增強相關(guān)結(jié)構(gòu)域(transcriptional enhanced associate domin,TEAD)等相互作用，促進新生心肌細胞增殖和胞質(zhì)分裂[94- 95]。在心臟發(fā)育過程中，Hippo還與Wnt-β-catenin、胰島素樣生長因子等信號相互作用，調(diào)控心肌細胞的生長和增殖[96]。但機械應(yīng)力是否通過Hippo信號直接調(diào)節(jié)YAP活性仍存在爭議，有研究發(fā)現(xiàn)在Fat4基因敲除的小鼠心臟中，核YAP活性增加，而Hippo相關(guān)激酶如大腫瘤抑制激酶(large tumor suppressor kinase，LATS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的磷酸化水平?jīng)]有改變[95，97]?？傊?，以Hippo-YAP通路為代表的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控著心臟發(fā)育過程中心肌細胞的增殖、凋亡、分化與成熟，從而影響正常的心臟發(fā)育與成熟，其可能是臨床上一個潛在的心肌治療靶點。

總 結(jié)

力學(xué)刺激在胚胎心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)有研究已證實，心內(nèi)膜細胞和心肌細胞表面的機械感受器可調(diào)控血流響應(yīng)的基因表達，但真實模擬分析體內(nèi)心臟發(fā)育的力學(xué)環(huán)境仍比較困難，近年來心臟生物工程及體內(nèi)成像技術(shù)的發(fā)展可能有助于進一步闡明復(fù)合力學(xué)刺激對胚胎心臟發(fā)育的影響。總之，結(jié)合遺傳因素和力學(xué)刺激等非遺傳因素深入研究CHD的病因及其發(fā)病機制，能為CHD的臨床防治工作提供更為堅實的理論基礎(chǔ)。