姚平波 劉雨露 朱子貴 趙 紅 張建新（長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

肺癌是最常見(jiàn)的致死癌癥種類(lèi)之一，全球每年大約新增140萬(wàn)肺癌新病例［1-2］。兩種主要的肺癌亞型是小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），二者比例分別為15%～20%和80%～85%［3］。盡管隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，NSCLC 的發(fā)生率在不斷減少，但其引起的病死率仍然很高，這可能與早期的快速轉(zhuǎn)移有關(guān)［4-6］。因此，尋找新的靶標(biāo)和預(yù)后的生物標(biāo)志物具有深遠(yuǎn)的意義。microRNA（miRNA）是小的非編碼RNA 分子，通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的表達(dá)［7］。miRNA通過(guò)多種信號(hào)通路參與腫瘤的形成、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移，揭示了其作為癌癥治療靶點(diǎn)的作用［8-9］。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，miRNA 在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)已經(jīng)被檢測(cè)［10］。研究發(fā)現(xiàn)miR-95-5p 參軟骨形成、敗血癥等多種疾病，但miR-95-5p 在肺癌中功能的相關(guān)研究較少［11-12］。這項(xiàng)研究的目的是研究miR-95-5p 在NSCLC 中的表達(dá)水平及其作為肺癌治療靶標(biāo)的潛力。本研究對(duì)患者的原發(fā)性肺癌組織及細(xì)胞系進(jìn)行了分析。以及揭示了miR-95-5p 對(duì)抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的治療作用，并進(jìn)一步確定了其靶基因SATB1和下游途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 正常肺細(xì)胞系HBE 和NSCLC 細(xì)胞系SPC-A1、H460、H1650和A549購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自上?；鄯f生物科技有限公司；miR-NC、miR-95-5p mimic、pc-NC、pc-SATB1 質(zhì)粒及各種引物的設(shè)計(jì)與合成由今唯智生物公司完成；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司；BCA 試劑盒、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自廣州市智取生物科技有限公司；SYBRGreen PCR 試劑盒購(gòu)自上海天篩科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、SATB1 兔來(lái)源的單克隆抗體購(gòu)自上海艾博抗生物科技有限公司。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.1.2 組織來(lái)源 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)時(shí)收集68 例NSCLC 患者腫瘤組織及腫瘤相鄰的正常組織，所有患者均簽署了有關(guān)臨床數(shù)據(jù)的書(shū)面知情同意書(shū)。該研究根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進(jìn)行，并獲得南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 正常肺細(xì)胞系HBE 和NSCLC細(xì)胞系SPC-A1、H460、H1650 和A549 所有細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2條件下，體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測(cè)miR-95-5p 與SATB1 mRNA的表達(dá) 將收集的組織樣品剪碎并研磨，用QIAzol裂解試劑提取總RNA，并用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將各細(xì)胞分別接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到近85%融合時(shí)，用QIAzol裂解試劑提取了總RNA，再通過(guò)cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR-Green PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定。反應(yīng)條件為：52℃2 min、95℃10 min、96℃15 s 和60℃1 min 的40 個(gè)循環(huán)，用U6 標(biāo)準(zhǔn)化，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。miR-95-5p 的正向引物序列：5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3'，反向引物序列：5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'；SATB1 的正向引物序列：5'-GATGGGGTCAGATGGAGAGA-3'，反向引物序列：5'-GAGACACCCTGGCATTGTTT-3'；U6 的正向引物序列：5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3'，反向引物序列：5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3'。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的各細(xì)胞接種于6孔板，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到85% 融合，根據(jù)Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)將100 nmol/L 的miR-NC、miR-95-5p mimic、pc-NC、pc-SATB1 質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染至H1650或A549細(xì)胞。

1.2.4 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處理后的H1650 和A549 細(xì)胞接種至96 孔板（1×105個(gè)/孔）中，然后分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo）來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，然后將CCK-8和培養(yǎng)基以1∶10的比例混合以制備混合溶液。丟棄先前使用的培養(yǎng)基，并在遠(yuǎn)離光的37℃下添加110 μl 的混合培養(yǎng)基再孵育1 h。最終，通過(guò)ELISA 檢查450 nm 處的OD 值，并且在每組中設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將Transwell小室置于24 孔板上方。先用胰蛋白酶消化，然后將轉(zhuǎn)染的H1650 和A549 細(xì)胞懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瑢⑵涿芏日{(diào)整為1×105個(gè)/ml，并向該室中添加上述細(xì)胞懸液。然后在培養(yǎng)箱中向無(wú)菌24 孔板中的細(xì)胞添加含10%FBS 的培養(yǎng)基。48 h 后，棄去培養(yǎng)基，然后用PBS 洗滌，取出Transwell 小室并用4%多聚甲醛固定30 min。加入0.5%的結(jié)晶紫染色10～15 min 后，用PBS 沖洗染色劑。最后，使用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞的觀察和計(jì)數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)miR-95-5p 和SATB1靶向關(guān)系 將SATB1 轉(zhuǎn)錄物的3'UTR 的序列克隆到含有熒光素酶報(bào)告基因作為WT 3'UTR 基團(tuán)的載體pGL3 中。使用定點(diǎn)誘變?cè)噭┖袑?'UTR 上的miRNA 的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)突變?yōu)闊o(wú)效的結(jié)合序列，以形成控制質(zhì)粒MUT 3'UTR 組。每組均轉(zhuǎn)染miR-95-5p模擬物和海腎熒光素酶質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h 后，將細(xì)胞培養(yǎng)液完全吸出。根據(jù)試劑盒的要求，加入適量的裂解液以完全裂解細(xì)胞。離心后，收獲100μl 裂解物的上清液用于測(cè)定。用螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)定的RLU 值除以海腎熒光素酶測(cè)定的RLU 值（以螢火蟲(chóng)熒光素酶為內(nèi)參）。根據(jù)獲得的比率，比較不同樣品靶報(bào)道基因的激活程度。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)SATB1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平 通過(guò)在12 000 g和4℃下離心20 min，提取總蛋白，并通過(guò)BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime）評(píng)估其濃度。然后，在10%SDS-PAGE 中分離出相同量的總蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉在含0.5%Tween-20 的TBS 中密封1 h。之后，加入一抗（SATB1 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000、β-catenin 1∶5 000、β-actin 1∶1 000）以在4℃下孵育過(guò)夜，然后漂洗蛋白質(zhì)并與二抗在室溫下孵育2 h，加顯影液，于Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)中曝光，使用軟件ImagePro plus6.0分析蛋白條帶，蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為目標(biāo)蛋白積分吸光度值與內(nèi)參蛋白GAPDH 積分吸光度值比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0分析，圖形采用GraphPad Prism 6.0 構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，多組比較進(jìn)行One-Way ANOVA 分析，兩組比較使用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-95-5p 在NSCLC 中的表達(dá)情況 為了評(píng)估m(xù)iR-95-5p 在NSCLC 中的表達(dá)水平，檢測(cè)了癌組織和癌旁正常組織、肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中miR-95-5p 表達(dá)水平。與癌旁正常組織比較，miR-95-5p在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)（圖1A，P＜0.01）；與正常肺癌細(xì)胞HBE 相比，NSCLC 細(xì)胞SPC-A1、H460、H1650 和A549 中miR-95-5p 表達(dá)下調(diào)（圖1B，P＜0.01）。上述結(jié)果顯示，A549 和H1650 細(xì)胞中miR-95-5p 表達(dá)較低，故選擇A549 和H1650 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。為了驗(yàn)證miR-95-5p 表達(dá)對(duì)NSCLC A549和H1650 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本課題組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了分組轉(zhuǎn)染。與miR-NC 組相比，miR-95-5p mimic 組NSCLC A549 和H1650 細(xì)胞miR-95-5p 表達(dá)上調(diào)（圖1C，P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)miR-95-5p mRNA 的表達(dá)水平Fig.1 miR-95-5p mRNA expression level detected by RT-qPCR

2.2 miR-95-5p 抑制A549 和H1650 細(xì)胞增殖和侵襲 為了評(píng)估m(xù)iR-95-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)NSCLC A549 和H1650 細(xì)胞增殖和侵襲的影響，運(yùn)用CCK-8 試劑盒檢測(cè)了各組細(xì)胞的增殖能力，運(yùn)用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞的侵襲能力。與miR-NC 組相比，miR-95-5p mimic 組NSCLC A549 和H1650 細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制（圖2A，P＜0.01）。與miR-NC 組相比，miR-95-5p mimic 組NSCLC A549 和H1650 細(xì)胞侵襲能力也受到明顯抑制（圖2B，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，miR-95-5p 抑制NSCLC A549 和H1650 細(xì)胞增殖和侵襲。

圖2 miR-95-5p 對(duì)A549 和H1650 細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響Fig.2 Effects of miR-95-5p on proliferation and invasion of A549 and H1650 cells

2.3 miR-95-5p 與SATB1 存在靶向關(guān)系 為了評(píng)估m(xù)iR-95-5p 對(duì)H1650 和A549 細(xì)胞增殖和侵襲抑制相關(guān)機(jī)制，研究了miR-95-5p 與SATB1 在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)性。TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-95-5p 與SATB1 3'UTR 區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。為了進(jìn)一步確認(rèn)二者關(guān)系，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證二者靶向關(guān)系。結(jié)果顯示在含有野生型SATB1 質(zhì)粒細(xì)胞中，miR-95-5p 高表達(dá)顯著抑制熒光素酶活性（P＜0.01，圖3B），但在含有突變型SATB1 質(zhì)粒細(xì)胞中，miR-95-5p 高表達(dá)對(duì)熒光素酶活性并無(wú)影響。Western blot 評(píng)估SATB1 表達(dá)結(jié)果如圖3C 所示，與miR-NC 組細(xì)胞相比，miR-95-5p組細(xì)胞中SATB1表達(dá)水平顯著下降；RT-qPCR評(píng)估SATB1 表達(dá)結(jié)果如圖3D 所示，與miR-NC 組細(xì)胞相比，miR-95-5p 組細(xì)胞中SATB1 明顯下降（P＜0.01）。以上結(jié)果表明miR-95-5p 與SATB1 存在良好的靶向關(guān)系。

圖3 miR-95-5p與SATB1靶向關(guān)系Fig.3 Targeting relationship of miR-95-5p and SATB1

2.4 SATB1對(duì)A549和H1650細(xì)胞增殖和侵襲的影響 由于SATB1 是miR-95-5p 的靶基因，因此檢查了SATB1 在肺癌患者組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，癌組織中的SATB1 表達(dá)明顯高于正常組織（P＜0.01，圖4A）。用SATB1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 和H1650細(xì)胞后，SATB1 表達(dá)顯著升高（P＜0.01，圖4B）。CCK-8 和Transwell 分析的結(jié)果表明，SATB1 表達(dá)的上調(diào)顯著促進(jìn)了肺癌A549 和H1650 細(xì)胞的增殖和侵襲能力（P＜0.01，圖4C、D）。

圖4 SATB1可促進(jìn)A549和H1650細(xì)胞增殖和侵襲Fig.4 SATB1 can promote proliferation and invasion of A549 and H1650 cells

2.5 miR-95-5p 通過(guò)抑制SATB1 表達(dá)發(fā)揮增殖和侵襲抑制作用 如圖5A 所示，SATB1 在A549 和H1650 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后，β-catenin 表達(dá)水平顯著升高。如圖5B 所示，升高的miR-95-5p 抑制了βcatenin 表達(dá)，但升高的SATB1 使其部分恢復(fù)。為了探討miR-95-5p 是否通過(guò)降低SATB1 發(fā)揮作用，開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，miR-95-5p 表達(dá)增加后，A549 和H1650 細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力顯著降低。然而，miR-95-5p和SATB1的表達(dá)均升高后，細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力有所升高（圖5C、D）。這表明miR-95-5p 可降低SATB1 的表達(dá)并通過(guò)其靶基因SATB1 抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制A549和H1650細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

圖5 miR-95-5p 通過(guò)抑制SATB1 表達(dá)發(fā)揮增殖和侵襲抑制作用Fig.5 miR-95-5p exerts proliferation and invasion inhibitory effects by inhibiting expression of SATB1

3 討論

目前NSCLC 治療最有前途的方法是手術(shù)切除和化療，盡管近年來(lái)醫(yī)療水平有很大的進(jìn)步，但NSCLC 治療的耐藥性仍是治療的障礙之一［13］。因此，急需深入了解NSCLC致病機(jī)制并尋找NSCLC發(fā)病和發(fā)展的重要分子生物學(xué)標(biāo)志。

miRNA 是用于癌癥的先進(jìn)分子診斷和靶向分子治療的出色工具［14］。最初認(rèn)識(shí)到miRNA 在腫瘤發(fā)生中的作用是研究人員發(fā)現(xiàn)miRNA 基因在白血病患者中被特異性刪除［15］。多項(xiàng)研究表明miRNA與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)，被認(rèn)為是包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的診斷和預(yù)后標(biāo)志物［16-17］。例如，miR-449、miR-141 等在NSCLC 中發(fā)揮抑癌作用，miR-155、miR-19b 等在NSCLC 中發(fā)揮致癌作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)miR-95-5p參與敗血癥、軟骨形成等疾病，但其在腫瘤中的報(bào)道相對(duì)較少。在本研究中，NSCLC組織和細(xì)胞SPC-A1、H460、H1650 和A549 中miR-95-5p 表達(dá)下調(diào)，推 測(cè)miR-95-5p 在NSCLC 中發(fā)揮抑癌作用。癌細(xì)胞的快速增殖能力和較強(qiáng)的侵襲能力是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要推動(dòng)因素［18］。因此控制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲情況對(duì)癌癥的治療至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-95-5p 過(guò)表達(dá)明顯抑制A549 和H1650 細(xì)胞增殖和侵襲，可見(jiàn)miR-95-5p在NSCLC中起抑癌作用。

為了進(jìn)一步揭示miR-95-5p 的潛在作用機(jī)制，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。使用TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-95-5p 的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-95-5p 與SATB1 3'UTR 區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在含有野生型SATB1質(zhì)粒細(xì)胞中，miR-95-5p高表達(dá)顯著抑制熒光素酶活性，但在含有突變型SATB1質(zhì)粒細(xì)胞中，miR-95-5p高表達(dá)對(duì)熒光素酶活性并無(wú)影響，結(jié)果表明SATB1 是miR-95-5p 潛在的靶標(biāo)基因。SATB1 是一種核基質(zhì)相關(guān)蛋白，通過(guò)染色質(zhì)重塑機(jī)制起作用來(lái)調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)［19］。SATB1 與Wnt-β-catenin 途徑相互作用，并且還與許多類(lèi)型的癌癥相關(guān)［20-21］。已知Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)調(diào)節(jié)多功能β-catenin 蛋白的能力來(lái)調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞過(guò)程，包括增殖、侵襲和分化，而β-catenin 蛋白質(zhì)是Wnt/β-catenin途徑中的重要信號(hào)分子［22-23］。

在本研究中，評(píng)估了SATB1 在肺癌中的表達(dá)，結(jié)果表明SATB1 在肺癌組織中高表達(dá)，并且與miR-95-5p表達(dá)呈反向。在A549和H1650細(xì)胞中，SATB1可能上調(diào)β-catenin 的表達(dá)，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。同時(shí)，miR-191-5p 可以降低β-catenin 表達(dá)，而SATB1 的上調(diào)可以挽救這種效應(yīng)。功能實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)SATB1 可以部分改善miR-95-5p 對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。綜上所述，推測(cè)miR-95-5p可能會(huì)抑制SATB1表達(dá)，然后部分抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而抑制A549和H1650細(xì)胞增殖和侵襲能力。

綜上所述，miR-95-5p 過(guò)表達(dá)靶向SATB1 抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制NSCLC 細(xì)胞H1650 和A549 的增殖及侵襲，因此miR-95-5p 和SATB1 有望成為NSCLC 的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)僅為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，有待進(jìn)一步研究動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)的分子信號(hào)通路。