黃玥 李旌 張茜 沈碧波 鄭巖

在糖尿病患者中，約有30%的人合并糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy DR)[1]。炎癥反應(yīng)、氧化壓力的升高和糖化蛋白的累積互相影響，是DR早期的重要病變機(jī)制。有證據(jù)表明在DR患者的房水中，白介素-6(interleukin-6，IL-6)和人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(human monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等的濃度顯著高于患糖尿病但是沒(méi)有視網(wǎng)膜臨床表現(xiàn)的病人，而后者又明顯高于正常血糖的對(duì)照組[2]。

增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)最主要的標(biāo)志是新生血管的形成[3，4]，而高血糖引起的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor VEGF)的上調(diào)是新生血管發(fā)生的主要原因[5]。高血糖引起的 VEGF的上調(diào)和一系列的炎性因子之間復(fù)雜的相互作用被認(rèn)為是PDR發(fā)展中的重要作用機(jī)制[6]。有實(shí)驗(yàn)表明抗VEGF治療可以減少白細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)血管收縮，加速血管成熟，因此從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)抗VEGF治療同時(shí)也有抗炎作用[7]。

玻璃體腔注射抗VEGF藥物目前已經(jīng)成為治療 PDR的重要手段[8]。那么抗VEGF治療會(huì)對(duì)PDR患者視網(wǎng)膜內(nèi)的炎癥和氧化壓力微環(huán)境帶來(lái)一些什么樣的變化呢？在本文中，我們將觀察PDR患者，在玻璃體腔注射抗VEGF 藥前后，房水中炎癥細(xì)胞因子VEGF、IL-6、MCP-1水平以及氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平的變化和他們之間的相關(guān)性，來(lái)進(jìn)一步探討PDR的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

資料與方法

一、對(duì)象

1.選取2016年3月至2017年11月在新華醫(yī)院眼科行玻璃體腔注射康柏西普藥，并行玻璃體切除術(shù)的PDR患者共74例(75只眼)入組，其中男性35例，女性39例，年齡(54.1±13.6)歲。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1999年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)糖尿病診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)，均為2型糖尿病，病程≥5年，<18年；PDR的診斷按照2002年悉尼國(guó)際臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他嚴(yán)重的心臟、肝、腎等全身疾病史者；有青光眼、葡萄膜炎等其他眼部疾病病史者；以前有過(guò)視網(wǎng)膜激光、玻璃體注射藥物史，眼部手術(shù)史者。

二、方法

前瞻性臨床研究。納入研究的每例患者均常規(guī)檢查裸眼視力、矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、眼部B型超聲、散瞳行檢眼鏡、眼底照相等檢查。納入研究的所有患者均被確診為PDR，并需要進(jìn)行玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療和玻璃體切除術(shù)治療。

1.操作過(guò)程：(1)患者于注射前3 d使用左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼，4次/d。3 d后，在新華醫(yī)院手術(shù)室行玻璃體腔注射。(2)術(shù)前0.5%奧布卡因滴眼，常規(guī)消毒鋪巾，0.5%聚維酮碘溶液沖洗結(jié)膜囊，固定眼球，在角膜緣內(nèi)1 mm進(jìn)行前房穿刺，吸取未經(jīng)稀釋的房水50～100 μl。然后距角膜緣3.5 mm的睫狀體平坦部垂直進(jìn)針，單次注射0.5 mg康柏西普，注射完后，妥布霉素地塞米松眼藥膏涂眼包扎。收集的房水立即放入-80 ℃的低溫冰箱保存。 (3)各研究對(duì)象在玻璃體腔注射抗VEGF藥后7 d，在新華醫(yī)院仍由同一位資深醫(yī)生行玻璃體切除術(shù)，術(shù)前0.5%奧布卡因滴眼，常規(guī)消毒鋪巾，0.5%聚維酮碘溶液沖洗結(jié)膜囊，固定眼球，在角膜緣內(nèi)1 mm進(jìn)行前房穿刺，吸取未經(jīng)稀釋的房水50～100 μl，取樣后常規(guī)行玻璃體切除術(shù)。收集的房水立即放入-80 ℃的低溫冰箱保存。

三、MDA定量

1.使用Abcam公司的Lipid Peroxidation (MDA) Assay kit試劑盒(貨號(hào)ab118970)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理為硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)與MDA的加成物MDA-TBA在OD 532 nm波長(zhǎng)激發(fā)光下有最大吸光度，可通過(guò)檢測(cè)OD 532 nm波長(zhǎng)激發(fā)光吸光度值進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的實(shí)驗(yàn)方法，步驟如下：(1)制備MDA梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液并對(duì)樣本溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋(房水樣本不稀釋)。(2)取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣本稀釋溶液各50 μl與150 μl TBA溶液進(jìn)行充分混合加入到96孔板中。(3)95 ℃環(huán)境下孵育60 min，冷卻至室溫后，在微孔板讀板機(jī)(microplate reader)上檢測(cè)OD 532 nm波長(zhǎng)激發(fā)光吸光度值。(4)根據(jù)各梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值和相應(yīng)濃度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本溶液中MDA的濃度值。

四、VEGF，IL-6，MCP-1定量

(1)采用 ELISA法檢測(cè)VEGF，IL-6，MCP-1的含量。(2)試驗(yàn)前將試劑和待測(cè)樣品置于室溫下(20～25 ℃)平衡。(3)按照要求用蒸餾水稀釋濃縮清洗液，充分混勻備用。(4)標(biāo)記好試驗(yàn)所需的微孔。(5)在微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，每孔加入100 μl，并做好相應(yīng)標(biāo)記。(6)將包被微孔板覆膜放置于37 ℃孵育60 min，充分棄盡孔內(nèi)的液體，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次。(7)每孔依照次序加入底物反應(yīng)液Ⅰ50 μl，再加入底物反應(yīng)液Ⅱ 50 μl，充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)5～30 min。(8)向各孔中加入終止液，輕輕混勻30秒。(9)在30 min之內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值。根據(jù)定比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ，根據(jù)樣品OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線 ，算出標(biāo)本中VEGF，IL-6，MCP-1的含量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用R3.4.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，藥物注射前后比較采用配對(duì)Wilcoxon檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、入組患者一般情況

本項(xiàng)研究一共納入了74例(75只眼)PDR的患者，年齡(54.1±13.6)歲，男性35例，女性39例，術(shù)前視力均低于0.3，其中玻璃體出血32只眼，視網(wǎng)膜下出血33只眼，伴有增生膜21只眼，牽拉性視網(wǎng)膜脫離7只眼。平時(shí)使用胰島素控制血糖的患者54例，口服降糖藥的有20例。注射抗VEGF藥前和行玻璃體切除術(shù)前患者空腹血糖均控制在8.0 mmol/l以下(見(jiàn)表1)。

表1 入組PDR患者的數(shù)據(jù)

二、玻璃體注射康柏西普前后房水中VEGF、MDA、IL-6和MCP-1水平的變化

玻璃體注射康柏西普后房水中IL-6和MCP-1濃度的個(gè)體差異較大，其濃度在注射后升高，配對(duì)Wilcoxon檢驗(yàn)證實(shí)其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而房水中的MDA濃度在注射后降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 PDR患者玻璃體注射康柏西普前后房水中細(xì)胞因子和MDA中位數(shù)水平的變化(pg/ml)

玻璃體注射康柏西普后VEGF濃度變化有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中63只眼房水中VEGF濃度低至不可測(cè)(0)，11只眼中檢測(cè)到低濃度的VEGF，分別為1.34 pg/ml，1.37 pg/ml，1.47 pg/ml，16.18 pg/ml，3.21 pg/ml，0.53 pg/ml，0.07 pg/ml，14.47 pg/ml，0.15 pg/ml，3.12 pg/ml，2.11 pg/ml(見(jiàn)表3)。

表3 PDR患者玻璃體注射康柏西普前后房水中VEGF中位數(shù)水平的變化(pg/ml)

三、PDR患者房水中細(xì)胞因子間以及MDA之間的相關(guān)性分析:

Spearman相關(guān)分析顯示，患者房水中IL-6和MCP-1濃度在注射康柏西普前后始終存在比較強(qiáng)的相關(guān)性(圖1，2)，其中注射前r=0.681，P<0.001，注射后r=0.614，P<0.001。IL-6和MCP-1本身在注射前后也存在較強(qiáng)的相關(guān)性(圖3，4)，其中IL-6注射前后r=0.376，P<0.05，MCP-1注射前后r=0.638，P<0.001。

圖1 房水pre-MCP1水平和pre-IL6水平的相關(guān)性

圖2 房水post-IL6水平和post-MCP1水平的相關(guān)性

圖3 房水pre-MCP1水平和pre-MDA水平的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，在注射康柏西普前，患者房水中MDA和MCP-1存在較強(qiáng)的相關(guān)性(圖3)，r=0.651，P<0.001。MDA和IL-6 也存在較強(qiáng)的相關(guān)性(圖4)，r=0.530，P>0.05。在注射康柏西普后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MDA和MCP-1的相關(guān)性，r=-0.323，P>0.05；也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MDA和IL-6的相關(guān)性，r=-0.372，P>0.05。

圖4 房水pre-IL6水平和pre-MDA水平的相關(guān)性

討 論

臨床上和傳統(tǒng)意義上DR一直被認(rèn)為是一個(gè)血管損傷性的疾病，直到上個(gè)世紀(jì)末，對(duì)于其病理的研究也主要集中在微循環(huán)異常方面，然而從這個(gè)世紀(jì)開(kāi)始，特別是近十年來(lái)，大量的基于糖尿病患者和動(dòng)物模型的研究表明糖尿病帶來(lái)的視網(wǎng)膜損傷在視網(wǎng)膜微循環(huán)異常顯現(xiàn)前就已經(jīng)存在，這主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，感光細(xì)胞的異常以及視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，例如Müller細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨６鴮?dǎo)致這些異常的一個(gè)重要原因在于長(zhǎng)期高糖導(dǎo)致的氧化壓力的增加和炎癥因子濃度的升高。促進(jìn)氧化壓力和炎癥因子濃度升高的因素除了視網(wǎng)膜本身代謝異常外，另一方面還可能是因?yàn)檠軡B透性增加導(dǎo)致的血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，從而使得外周血中的白細(xì)胞得以進(jìn)入視網(wǎng)膜組織，進(jìn)一步加劇了視網(wǎng)膜微環(huán)境的惡化，并促進(jìn)新生血管的形成?；谶@些研究結(jié)果，臨床上給予DR患者的抗炎癥藥物例如水楊酸鹽(阿司匹林)和米諾環(huán)素也證實(shí)了具有預(yù)防不可逆的血管和神經(jīng)損傷的作用[9]。

氧化微環(huán)境和炎癥微環(huán)境的破壞同時(shí)也推動(dòng)了DR病程的進(jìn)展。在PDR階段，由于VEGF濃度的長(zhǎng)期增高，新生血管出現(xiàn)。目前用抗VEGF藥物中和眼內(nèi)的VEGF從而阻止新生血管的生成，具有比較好的臨床效果，然而這個(gè)治療方法只適用于PDR，而且有相當(dāng)多的DR患者對(duì)這個(gè)治療方法并沒(méi)有有效的反應(yīng)，提示新的靶向治療的開(kāi)發(fā)勢(shì)在必行，而對(duì)于炎癥和氧化壓力的控制可能就是下一個(gè)控制DR發(fā)生發(fā)展的窗口[10]。

VEGF除了增加血管通透性外，本身具有趨化作用，尤其對(duì)巨噬細(xì)胞，因此可以直接加劇視網(wǎng)膜組織的炎癥反應(yīng)，那么抗VEGF治療是不是能對(duì)眼內(nèi)的炎癥微環(huán)境有緩解作用呢？我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)玻璃體腔內(nèi)康柏西普注射在短期內(nèi)(7 d)，MDA的濃度有明顯的降低，提示組織內(nèi)氧化壓力有減少的趨勢(shì)。但是卻沒(méi)有降低房水中IL-6和MCP-1的效果，反而有增高的趨勢(shì)。這可能和兩次取房水之間的間隔較短有關(guān)。

Forooghian等[11]等的研究中檢測(cè)了29例PDR患者，玻璃體注射抗VEGF藥后短期內(nèi)(7 d)眼房水中細(xì)胞因子的變化，發(fā)現(xiàn)IL-6、MCP-1和IL-8均較注射前增高。丁國(guó)龍等[12]對(duì)59例(63只眼)PDR患者房水中細(xì)胞因子的研究中也發(fā)現(xiàn)，雖然短期內(nèi)(7 d)玻璃體注射抗VEGF藥前后眼房水中細(xì)胞因子的變化無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但I(xiàn)L-6、MCP-1的濃度均呈增高趨勢(shì)。

但是Jeon等[13]等發(fā)現(xiàn)，玻璃體注射抗VEGF藥后，玻璃體腔內(nèi)炎性因子有升高的趨勢(shì)，但這個(gè)過(guò)程是急性且短暫的，注藥后1 d，IL-6、IL-8顯著升高；7 d后IL-6濃度顯著低于第1天，IL-8沒(méi)有變化；但是在1個(gè)月后IL-6、IL-8的濃度與注藥前無(wú)顯著差異。而Roxane等[14]在糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)患者中，連續(xù)2次的雷珠單抗注射(2個(gè)月)后，患者房水中的ICAM-1， VEGF，IL-6和MCP-1 濃度比注射前有顯著降低。

所以，玻璃體注射抗VEGF藥后炎癥因子的升高是短暫的，一方面可能是由于玻璃體內(nèi)注射聯(lián)合前房穿刺術(shù)引起了一系列的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致眼前房?jī)?nèi)炎性因子的短暫增高；另一方面，可能是眼內(nèi)VEGF被抑制后的代償反應(yīng)機(jī)制，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。我們的研究?jī)纱稳》克臅r(shí)間間隔為7 d，因此無(wú)法揭示玻璃體注射抗VEGF藥后玻璃體內(nèi)炎癥因子的變化趨勢(shì)，這給我們今后的研究提供了方向。

而玻璃體注射康柏西普后在短期內(nèi)(7 d)房水中MDA的濃度有明顯的降低，提示抗VEGF治療后組織內(nèi)氧化壓力有減少的趨勢(shì)。Vlatka Brzovi-ari[15]等的研究中提示，PDR患者血漿中VEGF水平與MDA水平呈顯著正相關(guān) (P<0.05)，SOD水平與年齡呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。Hiroshi Izuta[16]等的研究中發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體中VEGF水平與MDA水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。而鄭純[17]等認(rèn)為玻璃體注射抗VEGF藥物后能有效增強(qiáng)患者的抗氧化能力和減少過(guò)氧化物的蓄積，從而緩解視網(wǎng)膜的病理過(guò)程，最終改善病情。

另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)，所有研究對(duì)象房水中MCP-1、IL-6、MDA在注射康柏西普前后均有一定的相關(guān)性。

患者房水中IL-6和MCP-1濃度在注射康柏西普前后始終存在比較強(qiáng)的相關(guān)性，以及本身在注射前后也存在較強(qiáng)的相關(guān)性，提示了IL-6和MCP-1共同參與了PDR復(fù)雜的病理過(guò)程。在高血糖狀態(tài)下，MCP-1能活化白細(xì)胞，并介導(dǎo)其產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如IL-6等。而IL-6R/IL-6復(fù)合體又能刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成MCP-1，后者能強(qiáng)有力地趨化單核細(xì)胞，兩者起協(xié)同作用。

其次，我們研究還發(fā)現(xiàn)在注射康柏西普前，患者房水中MDA和MCP-1、IL-6均存在較強(qiáng)的相關(guān)性，提示了氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)在微血管病變中存在密切的相互作用。Domingueti等[18]等報(bào)道顯示，持續(xù)的高血糖狀態(tài)不僅促進(jìn)患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)也可以促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生。持續(xù)的高血糖導(dǎo)致蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，同樣炎癥因子的增加也可以刺激氧自由基的產(chǎn)生，形成正反饋效應(yīng)，促進(jìn)糖尿病患者微循環(huán)障礙，導(dǎo)致微血管并發(fā)癥的發(fā)生。本研究中檢測(cè)的MDA 是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，可作為機(jī)體氧化水平的標(biāo)志物[19]，IL-6和MCP-1是PDR的重要炎癥介質(zhì)，提示PDR患者中氧化應(yīng)激和炎癥存在相互促進(jìn)作用。

但是我們?cè)谘蹆?nèi)注射康柏西普后的PDR患者，眼內(nèi)VEGF水平顯著下降后，未發(fā)現(xiàn)房水中IL-6、MCP-1和MDA的相關(guān)性，從另一方面提示了VEGF不僅是血管發(fā)生和血管生成過(guò)程中的重要調(diào)控因子，也與高血糖狀態(tài)下氧化程度增高和炎癥反應(yīng)有關(guān)，它和IL-6、MCP-1之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制在PDR 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

本研究還根據(jù)性別對(duì)所有患者進(jìn)行分組，結(jié)果顯示注射前后性別對(duì)房水中IL-6、MCP-1和MDA水平均無(wú)影響。