周霖，王肖輝，李礪鋒，金建文，武婧，孫志，左莉華，趙杰▲，付智慧

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 超聲科，河南 鄭州 450052；3.陜西麗彩藥業(yè)有限公司，陜西 咸陽 712000；4.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 中醫(yī)藥學部，河南 鄭州 450052)

骨折(Fracture)是指骨的完整性或連續(xù)性中斷，畸形、反常活動、骨擦音或骨擦感是本病的典型癥狀。臨床表現(xiàn)包括疼痛與壓痛、局部腫脹與瘀斑、功能障礙等，嚴重者可發(fā)生休克，甚至危及生命[1]。骨折可發(fā)生于不同年齡段，多見于兒童及老年人，中青年也時有發(fā)生[2]，是影響患者生活質(zhì)量的重要因素之一。

復方傷痛膠囊，由當歸、桃仁、紅花、醋延胡索、大黃、柴胡、天花粉、甘草組成，具有活血祛瘀，行氣止痛的功效，用于急性胸壁扭挫傷之瘀滯證，也可用于骨折血瘀氣滯癥[3-6]。由于中藥是多組分、多靶點、多途徑協(xié)同作用構成的復雜體系，傳統(tǒng)的藥物研究模式很難闡明其作用機制，是當前中醫(yī)藥走向國際世界的關鍵技術壁壘。網(wǎng)絡藥理學可利用多種數(shù)據(jù)庫收集、整合研究材料，通過先進的數(shù)據(jù)處理方式，構建網(wǎng)絡水平的中藥分子及靶點、通路機制，是解決當前中藥研究難題的重要關鍵技術[7]。

有文獻[8]表明，復方傷痛膠囊具有調(diào)節(jié)骨組織修復及再生作用，能改善病變組織血液循環(huán)，防治瘀血阻塞加重病情，同時也能促進肉芽細胞、骨小梁、骨組織的增長，從而加快骨折的愈合，但從系統(tǒng)、全面、整體的角度對藥物的主要藥效物質(zhì)成分及具體作用機制進行研究的報道較少，存在一定的不足。本研究前期采用質(zhì)譜技術鑒定出復方傷痛膠囊中36個化學成分，并基于這些成分開展初步的網(wǎng)絡藥理學研究[9]。但限于當前分析技術的局限性，并未將藥物中所有的化學成分進行識別，識別到的物質(zhì)主要是含量相對較高的物質(zhì)，然而許多痕量物質(zhì)也是中藥發(fā)揮治療作用的主要物質(zhì)基礎，因此，此前研究可能存在一定的片面性。本研究擬基于龐大的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，更加系統(tǒng)全面地查找藥物成分，以期能夠多角度、多層次深入挖掘藥物治療復雜疾病的關鍵物質(zhì)及潛在作用機制。

本文采用網(wǎng)絡藥理學的方法，較為系統(tǒng)地篩選出復方傷痛膠囊治療骨折活性成分及作用靶點，構建“藥物-活性成分-靶點”“活性成分-重要靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡，系統(tǒng)探究藥物、活性成分、靶點、通路的內(nèi)在關聯(lián)機制，明確復方傷痛膠囊治療骨折的主要藥效成分、重要靶點和關鍵通路，為復方傷痛膠囊的臨床應用、質(zhì)量標準提升以及進一步的藥理作用驗證研究提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

Uniprot(https://www.uniprot.org/);TCMSP(http://tcmspw.com/index.php);DrugBank(https://www.drugbank.ca/);OMIM (http://www.omim.org);Genecards(https://www.genecards.org);Omicshare 云平臺(https://www.omicshare.com/);String(https://string-db.org/);DAVID(https://david.ncifcrf.gov/);Cytoscape 3.7.2軟件。

1.2 復方傷痛膠囊活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索復方傷痛膠囊各藥物的化學成分，并以OB≥30%和DL≥0.18[10-11]為限定條件對成分進行初步篩選；并通過查找相關文獻補充TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄的成分，得到藥物的主要活性成分及作用靶點。

1.3 復方傷痛膠囊活性成分作用靶點獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到以上活性成分對應的靶標蛋白，將靶標蛋白通過UniProt數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索查詢其對應的基因名稱。

1.4 復方傷痛膠囊治療骨折的潛在靶點預測

在OMIM數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫輸入“fracture”，檢索獲得骨折的作用靶點。使用OmicShare云平臺中的維恩圖軟件，將藥物預測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得復方傷痛膠囊治療骨折的潛在作用靶點。

1.5 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

將中藥材、活性成分及1.4項下所得的骨折潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，分析網(wǎng)絡拓撲性質(zhì)，采用network analyzer插件進行數(shù)據(jù)處理。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

將1.4項下潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫，勾選 multiple proteins，物種選擇Homo sapines，構建蛋白相互作用(PPI)關系圖。

1.7 Go富集分析和KEGG通路分析

為了進一步了解復方傷痛膠囊治療骨折的潛在靶點基因功能及作用，將所得靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，設置P<0.05，物種為Homo Sapiens，并將靶基因名稱校準為官方通用名稱(Official Gene Symbol)，進行GO和KEGG分析，最后按照其富集的靶點數(shù)目依次進行排序，選取排名靠前的10個條目繪制條形圖。GO富集分析選取(Biological Processes,BP)、(Molecular Function,MF)、(Cellular Component,CC)分別進行分析。

2 結果

2.1 復方傷痛膠囊的活性成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，設定OB≥30%、DL≥0.18，篩選出符合條件的化合物，檢索到大黃有效成分16個，當歸2個，柴胡17個，天花粉2個，桃仁23個，紅花22個，醋延胡索49個，甘草92個，去除共有成分，共計209個。

2.2 復方傷痛膠囊活性成分作用靶點

通過UniProt數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫，檢索到大黃潛在作用靶點65個，當歸潛在作用靶點49個，柴胡潛在作用靶點128個，天花粉潛在作用靶點3個，桃仁潛在作用靶點49個，紅花潛在作用靶點165個，延胡索潛在作用靶點131個，甘草潛在作用靶點170個，去除重復靶點，共計238個。

2.3 復方傷痛膠囊治療骨折的潛在靶點

通過OMIM 數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫輸入“fracture”，檢索、篩查并整合后共得到骨折作用靶點5 381個。使用OmicShare云平臺中的維恩圖軟件，將復方傷痛膠囊預測的靶點與骨折的靶點進行映射，獲得復方傷痛膠囊治療骨折的潛在作用靶點159個(見下圖1)。

圖1 復方傷痛膠囊治療骨折潛在靶點維恩圖

2.4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡模型及分析

采用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡模型(見下圖2)。該網(wǎng)絡共有351個節(jié)點(包括173個靶點節(jié)點，178個活性化合物節(jié)點)，共有2 265條邊(每條邊代表活性化合物與靶點基因之間的相互作用關系)。由圖可見復方傷痛膠囊中各藥物之間存在各種相互作用關系，同一成分對應不同的靶點，不同成分也可對應同一靶點，形成復雜的作用網(wǎng)絡，也充分體現(xiàn)了復方傷痛膠囊治療骨折的多成分、多靶點治療機制。

圖2 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡模型

2.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

將復方傷痛膠囊治療骨折的159個作用靶點導入string數(shù)據(jù)庫，保存其TSV格式文件。除去兩個逸出靶點，將文件中的node1，node2，combined score信息導入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制PPI網(wǎng)絡，并進行Network Analyze分析。如圖3所示，網(wǎng)絡中共包含157個節(jié)點(節(jié)點代表靶點)，2 706條邊(邊代表靶點之間的相互作用)，網(wǎng)絡中節(jié)點平均度值是34.5(度值表示連接到1個節(jié)點的線條數(shù)，線條越多表示關聯(lián)度越大，故可以評估網(wǎng)絡中每個節(jié)點的重要性)。圖中節(jié)點越大、顏色越深，則表明度值越大，大于平均度值的靶點有61個(居于圖3中間圓形的節(jié)點)，分別為AKT1、ALB、IL6、MAPK3、TP53、TNF、VEGFA、JUN、MAPK1、CASP3、EGFR、MMP9等。

圖3 復方傷痛膠囊治療骨折的PPI網(wǎng)絡

2.6 Go功能富集和KEGG通路分析

將以上靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，共得到GO富集條目266個，其中生物過程(BP)195個，分子功能(MF)42個，細胞組分(CC)29個；其中，BP方面與骨折相關的生物過程有22條，選取BP與骨折相關的十個條目、MF與CC排名前十位的條目，分別繪制條形圖，見圖4。BP主要富集在ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、炎癥反應、對平滑肌收縮的調(diào)節(jié)等；MF主要富集在蛋白質(zhì)同源二聚化活性、同蛋白結合、蛋白質(zhì)異源二聚體活性、血紅素結合、MAP激酶活性等；CC方面，在胞質(zhì)、細胞外空間、細胞核。KEGG通路分析結果，共得到信號通路119條，其中，與骨折密切相關的通路有22條，如圖5所示。

圖4 GO分析生物過程、分子功能、細胞組分情況

圖5 KEGG 通路富集分析

2.7 “活性成分-重要靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡模型及分析

基于以上結果信息，整理出藥物的活性成分、重要靶點和關鍵通路，導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“活性成分-重要靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡模型，如圖6所示，并進行Network Analyze分析。該網(wǎng)絡共有274個節(jié)點，1 509條邊，平均度值是11.01。圖中節(jié)點越大表明度值越大，大于平均度值的活性成分有21個，分別是木犀草素、山奈酚、槲皮素、甘草查爾酮A、β-谷甾醇、芒柄花黃素、黃芩素、柚皮素等；靶點有27個，分別是PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、F10、NOS2、PPARG等；信號通路有11條，分別是PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、破骨細胞分化等。

圖6 “活性成分-重要靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡

3 討論

中藥被廣泛應用于治療骨折、骨質(zhì)疏松等骨科相關疾病，已有許多動物實驗和臨床試驗證明中藥可刺激骨再生和抑制骨再吸收，最終促進骨折愈合。骨折愈合是一個復雜的生理過程，伴有局部血腫和局部炎癥的形成，愈合過程涉及成骨細胞的增殖、分化和基質(zhì)礦化。因此，控制炎癥、促進血液循環(huán)和刺激骨再生的藥物能改善骨折愈合[12]。

基于中藥多成分、多靶點的特殊性，為更加全面研究復方傷痛膠囊治療骨折的作用機制，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，系統(tǒng)構建復方傷痛膠囊的“中藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡及“關鍵成分-重要靶標-映射通路”網(wǎng)絡，并進行深入挖掘分析。最終經(jīng)篩選得到藥物的關鍵成分有木犀草素、山奈酚、槲皮素、甘草查爾酮A、β-谷甾醇、芒柄花黃素、黃芩素、柚皮素、異鼠李素等21個；關鍵靶點有PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、F10、NOS2、PPARG、MAPK14、ADRB2、CDK2、GSK3B等27個；映射的靶標通路為PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、破骨細胞分化、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、HIF-1信號通路、鈣信號通路、NOD樣受體信號通路、VEGF信號通路，共11條；涉及的生物過程主要有ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、炎癥反應、對平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路、對缺氧的反應、對受傷的反應、血管生成、MAPK級聯(lián)的正調(diào)控、血管生成的正調(diào)控、成肌細胞分化的負調(diào)控等。

本研究篩選的許多關鍵成分、靶點、通路與骨折的發(fā)生及愈合密切相關，體現(xiàn)本研究的科學性與合理性。其中木犀草素具有抗骨關節(jié)炎、骨肉瘤、骨損傷的作用[13-14]；山奈酚可通過調(diào)節(jié)Ca2+代謝平衡，促進骨膠原生成，減少骨小梁丟失，從而起到健骨的作用[15]；槲皮素可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和骨向分化，是其促進骨折愈合的關鍵細胞機制[16]；β-谷甾醇可刺激卵巢顆粒細胞分化，進而增強成骨作用，其主要通過提高成骨細胞OPG與PDF比值，從而調(diào)節(jié)骨代謝平衡[17]；黃芩素、柚皮素具有抑制破骨細胞的形成以及抑制破骨細胞的骨吸收功能[18-19]；以上成分均能從不同層面去促進骨形成、抑制骨吸收，促進骨折愈合。

在骨折愈合修復過程中，骨痂及血管的生成具有至關重要的作用。本研究富集的關鍵靶點VEGF，主要參與纖維骨痂的轉化、軟骨骨痂、骨性骨痂及其成熟骨痂的各個時期，并在血管的形成、軟骨的吸收與骨痂的改建的過程中起到關鍵作用，促進骨折的快速愈合[20]；同時，VEGF還能介導活化其下游的PI3K-Akt信號通路，活化的Akt在磷酸化后激活eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)，繼而催化合成NO，而NO能夠刺激血管舒張、血管重塑及血管的生成，有利于骨折的愈合[21]。同時，在骨折愈合過程中由于存在低氧環(huán)境，從而激活HIF信號通路，而VEGF作為HIF-1a最直接的靶基因之一可通過信號轉導來調(diào)控血管生成和骨形成[22]。此外，胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)可誘導間充質(zhì)干細胞形成骨表型，MAPK通路可刺激成骨基因和功能的表達；持續(xù)激活ERK2，促成骨細胞分化；磷酸化Smad-1，激活P38，促Alp表達及成骨細胞活化[23]。研究表明，鈣信號通路會與ERK交互作用來發(fā)揮對成骨細胞的抗凋亡或促凋亡作用，防止骨量丟失，有利于骨折的修復愈合[24]。Fox O家族中的Fox O3a與細胞凋亡密切相關，Akt1可使Fox O3a磷酸化，p-Fox O3a可抑制Bim的表達，減少caspase-3，從而抵御氧化應激，最終起到抗成骨細胞凋亡的作用[25]。骨折愈合一方面需要清除破壞，另一方面需要再生修復，其本質(zhì)就是骨折斷端發(fā)生骨吸收、骨形成與骨重建塑型的過程。其中，成骨細胞介導骨形成，破骨細胞介導骨吸收，兩者相互配合，在骨折愈合時，增強骨組織增殖形成，促使骨痂破壞清除，從而完成骨組織的再生修復[26]。本研究篩選的關鍵通路有保護成骨細胞存活及刺激破骨細胞活化的作用，是骨折愈后修復的關鍵作用環(huán)節(jié)。

復方傷痛膠囊的分子靶點治療網(wǎng)絡機制復雜，本研究通過構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡及“關鍵成分-重要靶標-映射通路”網(wǎng)絡，經(jīng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析后，篩選出核心活性成分及作用靶標，并進行生物學信息分析，預測復方傷痛膠囊治療骨折的復雜機制，為進一步的后續(xù)藥理研究奠定了扎實的前期基礎，也為更高效探究中藥治療復雜疾病的作用機制提供了科學的思路和方向。