申鳳霞 李倩 聶宗恒 馬云 范建偉 關(guān)永霞

糖尿病腎病是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥，也是引起終末期腎臟疾病的主要原因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，除遺傳因素外還涉及糖代謝異常、腎小球高壓、足細(xì)胞自噬、遺傳因素、活性氧生成過多及炎癥等多個方面[1]。本病發(fā)病率居高不下，且目前缺乏有效治療方案，因此，尋求有效的藥物來治療，緩解糖尿病腎病已迫在眉睫。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，在復(fù)雜疾病的預(yù)防和治療過程中具有自身的優(yōu)勢。防己以降為主，黃芪以升為要，兩藥相伍，一升一降，升降調(diào)和，共達(dá)補(bǔ)氣利水，祛風(fēng)止痛之功[2]。防己—黃芪配伍藥對出自東漢張仲景所著《金匱要略》中防己黃芪湯。黃芪性甘，微溫，入脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有保護(hù)腎組織、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、提高免疫功能、緩解肝損傷等作用；防己含有多種生物堿，主要為漢防己甲素(粉防己堿)、漢防己乙素(去甲基粉防己堿)、輪環(huán)藤季銨堿等，具有抗腎間質(zhì)纖維化、抗炎、降壓等藥理作用[4]。已有研究表明防己—黃芪藥對可以通過減少尿微量白蛋白以及降低腎臟指數(shù)發(fā)揮對早期腎損傷的保護(hù)作用[5]，但是關(guān)于黃芪—防己藥對治療糖尿病腎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及分子作用機(jī)制研究相對較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是集生物學(xué)、藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計算機(jī)技術(shù)等多學(xué)科交叉融合的系統(tǒng)生物學(xué)理論，構(gòu)建和整合“成分—靶點(diǎn)—疾病”等相互作用網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)和整體角度來探究藥物對機(jī)體的影響，揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用于機(jī)體發(fā)揮治療作用的機(jī)理，為中藥復(fù)方作用機(jī)制研究提供新的視角[6-7]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接分析黃芪—防己藥對干預(yù)糖尿病腎病的有效活性成分和作用靶點(diǎn)，分析其可能的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選與靶點(diǎn)收集

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫[8](https://tcmspw.com/tcmsp.php)收集防己—黃芪藥對中2味中藥的活性成分和靶點(diǎn)。根據(jù)藥物代謝動力學(xué)特性，本文以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件進(jìn)行活性成分的篩選[9-10]，并且將部分不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)但有文獻(xiàn)報道的與糖尿病腎病相關(guān)的成分也保留為活性成分。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載的靶點(diǎn)是靶點(diǎn)的蛋白名稱，需要進(jìn)一步將靶點(diǎn)的蛋白名導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫[11](https://www.uniprot.org/)，獲得靶點(diǎn)的基因名。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

將1.1中得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入CTD數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database, http://ctdbase.org/)[12]，利用該數(shù)據(jù)庫得到與靶點(diǎn)相關(guān)的疾病或者疾病癥狀對應(yīng)關(guān)系，從中篩選出與糖尿病腎病相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)GO富集分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析[13]，GO分析包括生物過程(biological process，GOBP)、分子功能(molecular function，GOMF)和細(xì)胞組成(cellular component，GOCC)3部分。將篩選得到的糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇“Functional Annotation”，Select Identifier選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Select Species選擇“Homo sapiens”，Background選擇“Homo sapiens”，點(diǎn)擊各個條目對應(yīng)的Chart獲得具體內(nèi)容，下載備用。選取下載結(jié)果中P<0.05的前20個條目繪制氣泡圖。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件[14]分別對防己—黃芪藥對里的活性成分—靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)—通路之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制。網(wǎng)絡(luò)圖里的節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分、靶點(diǎn)和通路，邊分別代表活性成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與通路之間的相互作用關(guān)系。

1.5 繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的與糖尿病腎病相關(guān)的靶點(diǎn)上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫，物種選擇：Homo sapiens(人)，選取置信度>0.7的數(shù)據(jù)，導(dǎo)出TSV格式文本，并將該文件導(dǎo)入Cytoscape軟件中繪制蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接與分析

將需要對接的活性成分輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫，下載其3D結(jié)構(gòu)式，利用ChemOffice 14.0軟件將活性成分的3D結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換為MOL2格式。從PDB數(shù)據(jù)庫下載需要對接靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)式，先運(yùn)用Pymol軟件對靶點(diǎn)進(jìn)行去溶劑分子、雜分子等初步處理，再利用AutoDockTools對靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)一步處理，進(jìn)行加極性氫、加電荷等處理，保存為pdbqt格式文件；最后運(yùn)用Autodock Vine對活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，根據(jù)結(jié)合能(affinity)評價化合物與靶點(diǎn)的匹配情況，用Pymol軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分與靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP平臺收集得到防風(fēng)的成分50個，黃芪的成分87個，經(jīng)篩選得到活性成分28個(防己9個，黃芪19個)，活性成分的詳細(xì)信息見表1。利用CTD數(shù)據(jù)庫篩選得到與糖尿病腎病相關(guān)的靶點(diǎn)95個。

表1 活性化合物的相關(guān)信息

2.2 靶點(diǎn)GO富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的與糖尿病腎病相關(guān)的95個靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，分別選取P≤0.5的GOBP、GOMF、GOCC的前20個條目繪制氣泡圖，見圖1～3?？v坐標(biāo)代表各個條目，橫坐標(biāo)代表參與該條目的靶點(diǎn)占總靶點(diǎn)的比例。GOBP主要涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、基因表達(dá)的正調(diào)控、凋亡過程的積極調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細(xì)胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)等；GOMF主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性、細(xì)胞因子活性、藥物結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性等；GOCC主要包含細(xì)胞核、胞質(zhì)溶膠、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞表面、蛋白質(zhì)復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、受體復(fù)合體等。

2.3 化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析

運(yùn)用Cytoscape繪制了活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。如圖4所示，共有123個節(jié)點(diǎn)，其中活性成分28個，靶點(diǎn)95個，圖中紫色的正方形代表活性成分，黃色的圓形代表靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的大小代表該節(jié)點(diǎn)度值的大小，連接線代表活性成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。其中活性成分的度值排名為：MOL10(槲皮素)、MOL24(黃芪甲苷)、MOL04(漢防己甲素)、MOL01(β-谷甾醇)、MOL26(山奈酚)。

圖4 化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖1 與糖尿病腎病相關(guān)的95個靶點(diǎn)的GOBP富集分析

圖2 與糖尿病腎病相關(guān)的95個靶點(diǎn)的GOMF富集分析

圖3 與糖尿病腎病相關(guān)的95個靶點(diǎn)的GOCC富集分析

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將95個靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[15]，獲得靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治?。如圖5所示，節(jié)點(diǎn)大小與度值大小呈正相關(guān)，圖中深色且大的節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)的度值排名為VEGFA、PTGS2、GSK3B、PPARG、TP53、MMP9、TNF等，這幾個靶點(diǎn)可能是防己—黃芪藥對治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 防己—黃芪藥對靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，通路富集結(jié)果顯示：防己—黃芪藥對的靶點(diǎn)主要富集在PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-κB信號通路、趨化因子信號通路、腎細(xì)胞癌、B細(xì)胞受體信號通路、鈣信號通路等，以發(fā)揮協(xié)同作用來治療糖尿病腎病。見圖6。

2.6 分子對接結(jié)果分析

根據(jù)活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖里活性成分度值的排名和相關(guān)的文獻(xiàn)報道，本研究將活性成分槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素與PPI網(wǎng)絡(luò)里的核心靶點(diǎn)PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG進(jìn)行分子對接，結(jié)果見圖7。槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素與PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG的結(jié)合能(affinity)均小于-5 kcal/mol，表明活性成分與核心靶點(diǎn)有較強(qiáng)的親和性，結(jié)合能見表2。

表2 防己—黃芪藥對活性成分與靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

3 討論

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，在復(fù)雜疾病的預(yù)防和治療過程中具有一定優(yōu)勢。本研究篩選出防己—黃芪藥對的有效成分28個，主要包括槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素、異鼠李素、β-谷甾醇及山奈酚等，關(guān)鍵靶點(diǎn)有PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG、TNF、TP53和MMP9等。上述活性成分及靶點(diǎn)對糖尿病腎病的治療作用已在相關(guān)的基礎(chǔ)研究中得到了證實。

Zhou等[16]通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定炎性細(xì)胞因子，并通過蛋白質(zhì)印跡法評估信號傳導(dǎo)途徑，研究結(jié)果表明黃芪甲苷IV明顯降低了單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型小鼠和脂多糖誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子，提示黃芪甲苷IV通過作用于TLR4/NF-кB信號傳導(dǎo)通路抑制炎癥來保護(hù)腎臟。漢防己己甲素是防己的主要成分，也是藥典里含量測定的指標(biāo)成分，有研究表明漢防己甲素能顯著抑制炎癥標(biāo)志物白細(xì)胞介素(interleukin，IL)6、IL-8和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達(dá)，抑制IκBα和NF-κB p65的磷酸化可能是漢防己甲素的一個抗炎作用機(jī)制[17]。槲皮素是一種廣泛存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗菌等藥理作用[18]。槲皮素能抑制大鼠腎組織中單核細(xì)胞趨化蛋白-1和大鼠血清中IL-6、TNF-α、超敏C反應(yīng)蛋白、纖溶酶原激活物抑制物-1等炎癥因子的表達(dá)，且槲皮素可以顯著降低大鼠腎組織的丙二醛水平，顯著提高超氧化物歧化酶活性，進(jìn)而緩解病大鼠腎組織病理損傷。槲皮素可能是通過改善氧化應(yīng)激和抑制炎癥反應(yīng)來改善腎功能[19]。異鼠李素能夠減輕糖尿病腎病大鼠的腎損傷指標(biāo)，且能明顯改善糖尿病大鼠腎臟的病理變化，起到緩解和治療糖尿病腎病的作用[20]。山奈酚緩解糖尿病腎病的藥理學(xué)作用已在糖尿病腎病模型大鼠中得到了證實，糖尿病腎病模型大鼠經(jīng)山奈酚腹腔注射后，尿蛋白、血清肌酐和尿素氮的含量明顯降低，腎組織損傷明顯減輕，凋亡細(xì)胞、炎性細(xì)胞明顯減少，炎癥因子IL-18、IL-1β的表達(dá)量明顯降低[21]。另有研究表明，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與腎系膜細(xì)胞的異常增殖密切有關(guān)，山奈酚能顯著抑制高糖誘導(dǎo)大鼠腎系膜細(xì)胞增殖[22]，對腎臟起到了一定的保護(hù)作用。β-谷甾醇是通過發(fā)揮抗炎和提高免疫力的作用來對抗糖尿病腎病，通過減少一氧化氮的合成，減少IL-1等炎性因子的分泌，提高抗炎因子IL-10的活性等發(fā)揮抗炎作用，亦可通過增加T淋巴細(xì)胞增殖來提高機(jī)體的免疫力[23]。

圖6 靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖

注：A PTGS2-槲皮素；B VEGFA-槲皮素；C GSK3B-槲皮素；D PPARG-槲皮素；E PTGS2-黃芪甲苷；F VEGFA-黃芪甲苷；G GSK3B-黃芪甲苷；H PPARG-黃芪甲苷；I PTGS2-漢防己甲素；J VEGFA-漢防己甲素；K GSK3B-漢防己甲素；L PPARG漢防己甲素。

越來越多的研究表明PTGS2與糖尿病腎病有著密切的關(guān)系，動物實驗結(jié)果表明患有糖尿病腎病的大鼠體內(nèi)PTGS2表達(dá)量明顯高于對照組，且應(yīng)用PTGS2抑制劑能顯著改善腎臟的損傷，進(jìn)而改善腎臟功能[24]。孫京華等[25]的實驗研究表明，給予糖尿病腎病模型大鼠以黃芪注射液灌胃可顯著降低大鼠腎組織PTGS2的表達(dá)。在電鏡下觀察腎組織的病理學(xué)變化，黃芪灌胃組的腎組織病理改變較對照組有所減輕，因此抑制PTGS2的表達(dá)有助于糖尿病腎病的治療。DPP4又被稱為T細(xì)胞表面抗原CD26，有研究發(fā)現(xiàn)DPP4抑制劑可以預(yù)防糖尿病患者的腎功能損害，并且能夠抑制炎癥因子的表達(dá)，有望成為治療糖尿病腎病的有效靶點(diǎn)[26]。PPARG是過氧化物酶體增殖物激活受體家族中的一個亞型，是一種重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子。黃曉霞等[27]對高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)PPARG及其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明高糖可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)PPARG的表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，最終導(dǎo)致腎纖維化。由此推測維持PPARG的正常表達(dá)對腎小管上皮細(xì)胞有保護(hù)作用，進(jìn)而對腎臟起到一定的保護(hù)作用，因此PPARG可能是防治糖尿病腎病導(dǎo)致的腎纖維化的一個新靶點(diǎn)。

近幾年較多的研究表明血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的異常表達(dá)與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和血小板生長因子，通常所說的VEGF即指的是VEGFA。VEGF主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管和集合管，對維持腎小球濾過屏障的完整性和足細(xì)胞活性有重要意義[28]，研究表明，VEGF是足細(xì)胞表達(dá)的主要細(xì)胞因子，在糖尿病腎病早期，VEGF的表達(dá)顯著增多，從而引起進(jìn)展性蛋白尿、腎小球塌陷，導(dǎo)致腎功能衰竭[29]，提示防己—黃芪藥對或可通過抑制糖尿病腎病大鼠腎臟組織中VEGF蛋白的表達(dá)，抑制糖尿病腎病大鼠的機(jī)體腎小管間質(zhì)病變，減輕腎臟的病理性損傷，進(jìn)而改善腎功能[30]。

GSK3B是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有多種功能，廣泛存在于真核細(xì)胞中，GSK3B除了催化糖原合成酶的磷酸化外，在細(xì)胞分化、代謝、凋亡和炎癥中也有調(diào)節(jié)作用[31]。先前的研究表明，GSK3B通過其下游底物(包括NF-κB和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)的作用調(diào)節(jié)各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而平衡促炎和抗炎反應(yīng)[32]。因此，GSK3B的抑制可能在炎癥的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[33]。由于炎癥是糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)鍵因素[34]，GSK3B的抑制可能被認(rèn)為是一個有前途的治療靶點(diǎn)。高表達(dá)的TNF-α刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生過量的氧自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝旺盛，其代謝產(chǎn)物增多，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球血管通透性增加，引起尿蛋白的生產(chǎn)，因此抑制TNF-α的表達(dá)對糖尿病腎病的治療起到一定的作用[35]。分子對接結(jié)果表明，防己—黃芪藥對中的有效成分槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素與PTGS2、VEGFA、GSK3B和PPARG的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明防己—黃芪藥對的活性成分可能通過作用于上述靶點(diǎn)從而影響糖尿病腎病的病理發(fā)展變化。

KEGG通路富集篩選得到與糖尿病腎病相關(guān)的通路21條，其中NF-κB信號通路的激活參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程，該通路不僅僅可以維持腎臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，還參與炎性反應(yīng)[36]，抑制NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而減輕炎癥損傷，起到防治糖尿病腎病的作用。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)信號通路主要在先天免疫中發(fā)揮作用，調(diào)控免疫細(xì)胞來表達(dá)相關(guān)的免疫蛋白，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[37]。PI3K-Akt信號通路細(xì)胞生長、增殖等的調(diào)控中具有重要作用，防己—黃芪藥對可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路來改善異常增殖的腎臟細(xì)胞，從而起到緩解治療糖尿病腎病的作用[38]。FoxO信號通路受上游PI3K-Akt信號通路的調(diào)控，參與細(xì)胞增殖的調(diào)控與糖代謝的調(diào)節(jié)[38]。TLRs是介導(dǎo)先天免疫與獲得性免疫的跨膜信號傳遞受體，TLRs信號通路的激活可以活化NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，同時調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[39]。這些信號通路在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展和治療過程中起著重要作用，表明防己—黃芪藥對可能作用于這些信號通路，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，改善腎臟細(xì)胞的異常，參與糖代謝等，進(jìn)而發(fā)揮對糖尿病腎病的治療作用。

綜上所述，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法分析防己—黃芪藥對治療糖尿病腎病的有效活性成分、作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制。該藥對可能是通過槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素、異鼠李素、β-谷甾醇及山奈酚等活性成分，作用于PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG、TNF、TP53、MMP9等靶點(diǎn)，涉及PI3K-Akt信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、NF-κB信號通路、腎細(xì)胞癌、鈣信號通路等機(jī)制來實現(xiàn)治療糖尿病腎病的目的。本研究揭示了該藥對多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用于機(jī)體發(fā)揮治療作用的機(jī)理，為以后的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。然而本研究僅借助于多個數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行理論分析，所得結(jié)論仍需要通過進(jìn)一步實驗加以驗證。