申鳳霞 李倩 聶宗恒 馬云 范建偉 關永霞

糖尿病腎病是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥，也是引起終末期腎臟疾病的主要原因，其發(fā)病機制復雜且尚不明確，除遺傳因素外還涉及糖代謝異常、腎小球高壓、足細胞自噬、遺傳因素、活性氧生成過多及炎癥等多個方面[1]。本病發(fā)病率居高不下，且目前缺乏有效治療方案，因此，尋求有效的藥物來治療，緩解糖尿病腎病已迫在眉睫。

中藥具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點，在復雜疾病的預防和治療過程中具有自身的優(yōu)勢。防己以降為主，黃芪以升為要，兩藥相伍，一升一降，升降調(diào)和，共達補氣利水，祛風止痛之功[2]。防己—黃芪配伍藥對出自東漢張仲景所著《金匱要略》中防己黃芪湯。黃芪性甘，微溫，入脾、肺經(jīng)，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[3]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有保護腎組織、抗腫瘤、保護心腦血管、提高免疫功能、緩解肝損傷等作用；防己含有多種生物堿，主要為漢防己甲素(粉防己堿)、漢防己乙素(去甲基粉防己堿)、輪環(huán)藤季銨堿等，具有抗腎間質(zhì)纖維化、抗炎、降壓等藥理作用[4]。已有研究表明防己—黃芪藥對可以通過減少尿微量白蛋白以及降低腎臟指數(shù)發(fā)揮對早期腎損傷的保護作用[5]，但是關于黃芪—防己藥對治療糖尿病腎病的藥效物質(zhì)基礎以及分子作用機制研究相對較少。

網(wǎng)絡藥理學是集生物學、藥理學、生物信息學、計算機技術(shù)等多學科交叉融合的系統(tǒng)生物學理論，構(gòu)建和整合“成分—靶點—疾病”等相互作用網(wǎng)絡，從系統(tǒng)和整體角度來探究藥物對機體的影響，揭示中藥復方多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用于機體發(fā)揮治療作用的機理，為中藥復方作用機制研究提供新的視角[6-7]。本文運用網(wǎng)絡藥理學與分子對接分析黃芪—防己藥對干預糖尿病腎病的有效活性成分和作用靶點，分析其可能的作用機制，以期為臨床應用和新藥開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選與靶點收集

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫[8](https://tcmspw.com/tcmsp.php)收集防己—黃芪藥對中2味中藥的活性成分和靶點。根據(jù)藥物代謝動力學特性，本文以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件進行活性成分的篩選[9-10]，并且將部分不符合篩選標準但有文獻報道的與糖尿病腎病相關的成分也保留為活性成分。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載的靶點是靶點的蛋白名稱，需要進一步將靶點的蛋白名導入UniProt數(shù)據(jù)庫[11](https://www.uniprot.org/)，獲得靶點的基因名。

1.2 疾病靶點篩選

將1.1中得到的靶點導入CTD數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database, http://ctdbase.org/)[12]，利用該數(shù)據(jù)庫得到與靶點相關的疾病或者疾病癥狀對應關系，從中篩選出與糖尿病腎病相關的靶點。

1.3 靶點GO富集分析

運用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對靶點進行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析[13]，GO分析包括生物過程(biological process，GOBP)、分子功能(molecular function，GOMF)和細胞組成(cellular component，GOCC)3部分。將篩選得到的糖尿病腎病相關靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇“Functional Annotation”，Select Identifier選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Select Species選擇“Homo sapiens”，Background選擇“Homo sapiens”，點擊各個條目對應的Chart獲得具體內(nèi)容，下載備用。選取下載結(jié)果中P<0.05的前20個條目繪制氣泡圖。

1.4 網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

運用Cytoscape 3.6.1軟件[14]分別對防己—黃芪藥對里的活性成分—靶點的關系網(wǎng)絡、靶點—通路之間的關系網(wǎng)絡進行繪制。網(wǎng)絡圖里的節(jié)點分別代表活性成分、靶點和通路，邊分別代表活性成分與靶點、靶點與通路之間的相互作用關系。

1.5 繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

將篩選得到的與糖尿病腎病相關的靶點上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫，物種選擇：Homo sapiens(人)，選取置信度>0.7的數(shù)據(jù)，導出TSV格式文本，并將該文件導入Cytoscape軟件中繪制蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡。

1.6 分子對接與分析

將需要對接的活性成分輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫，下載其3D結(jié)構(gòu)式，利用ChemOffice 14.0軟件將活性成分的3D結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換為MOL2格式。從PDB數(shù)據(jù)庫下載需要對接靶點的3D結(jié)構(gòu)式，先運用Pymol軟件對靶點進行去溶劑分子、雜分子等初步處理，再利用AutoDockTools對靶點和活性成分進一步處理，進行加極性氫、加電荷等處理，保存為pdbqt格式文件；最后運用Autodock Vine對活性成分和靶點進行分子對接，根據(jù)結(jié)合能(affinity)評價化合物與靶點的匹配情況，用Pymol軟件對結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分與靶點的篩選

通過TCMSP平臺收集得到防風的成分50個，黃芪的成分87個，經(jīng)篩選得到活性成分28個(防己9個，黃芪19個)，活性成分的詳細信息見表1。利用CTD數(shù)據(jù)庫篩選得到與糖尿病腎病相關的靶點95個。

表1 活性化合物的相關信息

2.2 靶點GO富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的與糖尿病腎病相關的95個靶點進行GO分析，分別選取P≤0.5的GOBP、GOMF、GOCC的前20個條目繪制氣泡圖，見圖1～3?？v坐標代表各個條目，橫坐標代表參與該條目的靶點占總靶點的比例。GOBP主要涉及炎癥反應、細胞增殖、基因表達的正調(diào)控、凋亡過程的積極調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細胞對腫瘤壞死因子的反應等；GOMF主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性、細胞因子活性、藥物結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性等；GOCC主要包含細胞核、胞質(zhì)溶膠、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細胞質(zhì)核周區(qū)域、細胞外基質(zhì)、細胞表面、蛋白質(zhì)復合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、受體復合體等。

2.3 化合物—靶點網(wǎng)絡圖分析

運用Cytoscape繪制了活性成分—靶點網(wǎng)絡圖。如圖4所示，共有123個節(jié)點，其中活性成分28個，靶點95個，圖中紫色的正方形代表活性成分，黃色的圓形代表靶點，節(jié)點的大小代表該節(jié)點度值的大小，連接線代表活性成分與靶點之間的相互作用關系。其中活性成分的度值排名為：MOL10(槲皮素)、MOL24(黃芪甲苷)、MOL04(漢防己甲素)、MOL01(β-谷甾醇)、MOL26(山奈酚)。

圖4 化合物—靶點網(wǎng)絡圖

圖1 與糖尿病腎病相關的95個靶點的GOBP富集分析

圖2 與糖尿病腎病相關的95個靶點的GOMF富集分析

圖3 與糖尿病腎病相關的95個靶點的GOCC富集分析

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡

將95個靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫[15]，獲得靶點與靶點之間的相互作用關系，將得到的數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件中，構(gòu)建交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡，使用Network Analyzer進行拓撲分析。如圖5所示，節(jié)點大小與度值大小呈正相關，圖中深色且大的節(jié)點為核心靶點，核心靶點的度值排名為VEGFA、PTGS2、GSK3B、PPARG、TP53、MMP9、TNF等，這幾個靶點可能是防己—黃芪藥對治療糖尿病腎病的關鍵靶點。

圖5 防己—黃芪藥對靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

2.5 靶點—通路網(wǎng)絡圖分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶點進行通路富集分析，通路富集結(jié)果顯示：防己—黃芪藥對的靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、T細胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-κB信號通路、趨化因子信號通路、腎細胞癌、B細胞受體信號通路、鈣信號通路等，以發(fā)揮協(xié)同作用來治療糖尿病腎病。見圖6。

2.6 分子對接結(jié)果分析

根據(jù)活性成分—靶點網(wǎng)絡圖里活性成分度值的排名和相關的文獻報道，本研究將活性成分槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素與PPI網(wǎng)絡里的核心靶點PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG進行分子對接，結(jié)果見圖7。槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素與PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG的結(jié)合能(affinity)均小于-5 kcal/mol，表明活性成分與核心靶點有較強的親和性，結(jié)合能見表2。

表2 防己—黃芪藥對活性成分與靶點的分子對接結(jié)果

3 討論

中藥具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點，在復雜疾病的預防和治療過程中具有一定優(yōu)勢。本研究篩選出防己—黃芪藥對的有效成分28個，主要包括槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素、異鼠李素、β-谷甾醇及山奈酚等，關鍵靶點有PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG、TNF、TP53和MMP9等。上述活性成分及靶點對糖尿病腎病的治療作用已在相關的基礎研究中得到了證實。

Zhou等[16]通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定炎性細胞因子，并通過蛋白質(zhì)印跡法評估信號傳導途徑，研究結(jié)果表明黃芪甲苷IV明顯降低了單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型小鼠和脂多糖誘導的上皮細胞中的促炎細胞因子，提示黃芪甲苷IV通過作用于TLR4/NF-кB信號傳導通路抑制炎癥來保護腎臟。漢防己己甲素是防己的主要成分，也是藥典里含量測定的指標成分，有研究表明漢防己甲素能顯著抑制炎癥標志物白細胞介素(interleukin，IL)6、IL-8和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達，抑制IκBα和NF-κB p65的磷酸化可能是漢防己甲素的一個抗炎作用機制[17]。槲皮素是一種廣泛存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗菌等藥理作用[18]。槲皮素能抑制大鼠腎組織中單核細胞趨化蛋白-1和大鼠血清中IL-6、TNF-α、超敏C反應蛋白、纖溶酶原激活物抑制物-1等炎癥因子的表達，且槲皮素可以顯著降低大鼠腎組織的丙二醛水平，顯著提高超氧化物歧化酶活性，進而緩解病大鼠腎組織病理損傷。槲皮素可能是通過改善氧化應激和抑制炎癥反應來改善腎功能[19]。異鼠李素能夠減輕糖尿病腎病大鼠的腎損傷指標，且能明顯改善糖尿病大鼠腎臟的病理變化，起到緩解和治療糖尿病腎病的作用[20]。山奈酚緩解糖尿病腎病的藥理學作用已在糖尿病腎病模型大鼠中得到了證實，糖尿病腎病模型大鼠經(jīng)山奈酚腹腔注射后，尿蛋白、血清肌酐和尿素氮的含量明顯降低，腎組織損傷明顯減輕，凋亡細胞、炎性細胞明顯減少，炎癥因子IL-18、IL-1β的表達量明顯降低[21]。另有研究表明，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與腎系膜細胞的異常增殖密切有關，山奈酚能顯著抑制高糖誘導大鼠腎系膜細胞增殖[22]，對腎臟起到了一定的保護作用。β-谷甾醇是通過發(fā)揮抗炎和提高免疫力的作用來對抗糖尿病腎病，通過減少一氧化氮的合成，減少IL-1等炎性因子的分泌，提高抗炎因子IL-10的活性等發(fā)揮抗炎作用，亦可通過增加T淋巴細胞增殖來提高機體的免疫力[23]。

圖6 靶點—通路網(wǎng)絡圖

注：A PTGS2-槲皮素；B VEGFA-槲皮素；C GSK3B-槲皮素；D PPARG-槲皮素；E PTGS2-黃芪甲苷；F VEGFA-黃芪甲苷；G GSK3B-黃芪甲苷；H PPARG-黃芪甲苷；I PTGS2-漢防己甲素；J VEGFA-漢防己甲素；K GSK3B-漢防己甲素；L PPARG漢防己甲素。

越來越多的研究表明PTGS2與糖尿病腎病有著密切的關系，動物實驗結(jié)果表明患有糖尿病腎病的大鼠體內(nèi)PTGS2表達量明顯高于對照組，且應用PTGS2抑制劑能顯著改善腎臟的損傷，進而改善腎臟功能[24]。孫京華等[25]的實驗研究表明，給予糖尿病腎病模型大鼠以黃芪注射液灌胃可顯著降低大鼠腎組織PTGS2的表達。在電鏡下觀察腎組織的病理學變化，黃芪灌胃組的腎組織病理改變較對照組有所減輕，因此抑制PTGS2的表達有助于糖尿病腎病的治療。DPP4又被稱為T細胞表面抗原CD26，有研究發(fā)現(xiàn)DPP4抑制劑可以預防糖尿病患者的腎功能損害，并且能夠抑制炎癥因子的表達，有望成為治療糖尿病腎病的有效靶點[26]。PPARG是過氧化物酶體增殖物激活受體家族中的一個亞型，是一種重要的細胞分化轉(zhuǎn)錄因子。黃曉霞等[27]對高糖刺激的腎小管上皮細胞內(nèi)PPARG及其mRNA表達水平進行檢測，結(jié)果表明高糖可導致腎小管上皮細胞內(nèi)PPARG的表達下調(diào)，促進腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，最終導致腎纖維化。由此推測維持PPARG的正常表達對腎小管上皮細胞有保護作用，進而對腎臟起到一定的保護作用，因此PPARG可能是防治糖尿病腎病導致的腎纖維化的一個新靶點。

近幾年較多的研究表明血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的異常表達與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和血小板生長因子，通常所說的VEGF即指的是VEGFA。VEGF主要表達于腎小球足細胞、遠端腎小管和集合管，對維持腎小球濾過屏障的完整性和足細胞活性有重要意義[28]，研究表明，VEGF是足細胞表達的主要細胞因子，在糖尿病腎病早期，VEGF的表達顯著增多，從而引起進展性蛋白尿、腎小球塌陷，導致腎功能衰竭[29]，提示防己—黃芪藥對或可通過抑制糖尿病腎病大鼠腎臟組織中VEGF蛋白的表達，抑制糖尿病腎病大鼠的機體腎小管間質(zhì)病變，減輕腎臟的病理性損傷，進而改善腎功能[30]。

GSK3B是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有多種功能，廣泛存在于真核細胞中，GSK3B除了催化糖原合成酶的磷酸化外，在細胞分化、代謝、凋亡和炎癥中也有調(diào)節(jié)作用[31]。先前的研究表明，GSK3B通過其下游底物(包括NF-κB和cAMP反應元件結(jié)合蛋白)的作用調(diào)節(jié)各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而平衡促炎和抗炎反應[32]。因此，GSK3B的抑制可能在炎癥的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[33]。由于炎癥是糖尿病腎病發(fā)病的關鍵因素[34]，GSK3B的抑制可能被認為是一個有前途的治療靶點。高表達的TNF-α刺激腎小球系膜細胞產(chǎn)生過量的氧自由基，導致脂質(zhì)代謝旺盛，其代謝產(chǎn)物增多，進而導致腎小球血管通透性增加，引起尿蛋白的生產(chǎn)，因此抑制TNF-α的表達對糖尿病腎病的治療起到一定的作用[35]。分子對接結(jié)果表明，防己—黃芪藥對中的有效成分槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素與PTGS2、VEGFA、GSK3B和PPARG的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明防己—黃芪藥對的活性成分可能通過作用于上述靶點從而影響糖尿病腎病的病理發(fā)展變化。

KEGG通路富集篩選得到與糖尿病腎病相關的通路21條，其中NF-κB信號通路的激活參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程，該通路不僅僅可以維持腎臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，還參與炎性反應[36]，抑制NF-κB信號通路的激活，進而減輕炎癥損傷，起到防治糖尿病腎病的作用。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)信號通路主要在先天免疫中發(fā)揮作用，調(diào)控免疫細胞來表達相關的免疫蛋白，進而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[37]。PI3K-Akt信號通路細胞生長、增殖等的調(diào)控中具有重要作用，防己—黃芪藥對可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路來改善異常增殖的腎臟細胞，從而起到緩解治療糖尿病腎病的作用[38]。FoxO信號通路受上游PI3K-Akt信號通路的調(diào)控，參與細胞增殖的調(diào)控與糖代謝的調(diào)節(jié)[38]。TLRs是介導先天免疫與獲得性免疫的跨膜信號傳遞受體，TLRs信號通路的激活可以活化NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，進而誘導炎性因子的表達，參與炎癥反應的調(diào)控，同時調(diào)節(jié)免疫應答[39]。這些信號通路在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展和治療過程中起著重要作用，表明防己—黃芪藥對可能作用于這些信號通路，調(diào)節(jié)炎癥反應、免疫反應，改善腎臟細胞的異常，參與糖代謝等，進而發(fā)揮對糖尿病腎病的治療作用。

綜上所述，本文運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法分析防己—黃芪藥對治療糖尿病腎病的有效活性成分、作用靶點及其可能的作用機制。該藥對可能是通過槲皮素、黃芪甲苷、漢防己甲素、異鼠李素、β-谷甾醇及山奈酚等活性成分，作用于PTGS2、VEGFA、GSK3B、PPARG、TNF、TP53、MMP9等靶點，涉及PI3K-Akt信號通路、T細胞受體信號通路、NF-κB信號通路、腎細胞癌、鈣信號通路等機制來實現(xiàn)治療糖尿病腎病的目的。本研究揭示了該藥對多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用于機體發(fā)揮治療作用的機理，為以后的臨床應用和新藥開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。然而本研究僅借助于多個數(shù)據(jù)庫信息進行理論分析，所得結(jié)論仍需要通過進一步實驗加以驗證。