楊臻瑞 史曉光 汪唐順 左禧萌 劉潔麗 馮雪 王玉坤 陸葉麗

三陰性乳腺癌為一類雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)均為陰性的乳腺癌，雖然其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較其他類型乳腺癌更高，但目前的治療方案局限于手術(shù)、放化療及靶向治療等，難以達(dá)到理想效果[1]。近年來(lái)槐耳顆粒已被證實(shí)能夠輔助化療治療三陰性乳腺癌[2]，其作用機(jī)制考慮為抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)化療耐藥及抗腫瘤心血管生成等[3]。本研究探討槐耳顆?？鼓[瘤對(duì)磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin，PI3K-AKT-mTOR)信號(hào)通路的作用，并以此探究其治療三陰性乳腺癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞系經(jīng)STR鑒定且無(wú)支原體。以DMEM高糖溶液(Biosharp，中國(guó))加入10%胎牛血清(四季青，中國(guó))和青霉素(100 U/mL)鏈霉素(100 mg/mL)溶液(Biosharp，中國(guó))配置為完全培養(yǎng)基后培養(yǎng),培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃的加濕培養(yǎng)箱。

1.2 主要試劑

槐耳顆粒(啟東蓋天力有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000109)，用DMEM充分溶解，制成終濃度為16 mg/mL的培養(yǎng)基母液，0.22 μm濾膜過(guò)濾2次，短期(一周內(nèi))4℃保存。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)檢測(cè)試劑盒(Biosharp，中國(guó)),原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，Tunel)凋亡熒光檢測(cè)試劑盒(Proteintech，中國(guó))，蛋白酶抑制劑cocktail、RIPA細(xì)胞裂解液(索萊寶，中國(guó))，磷脂酰肌醇3 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抗體PI3K p85(60225-1-Ig，1∶10000)，雷帕霉素靶蛋白抗體(mammalian target of rapamycin，mTOR)(20657-1-AP，1∶10000)，蛋白激酶抗體(protein kinase B，Akt)(10176-2-AP，1∶10000)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(10494-1-AP，1∶40000)，山羊抗兔IgG(H&L)二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00001-2)。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性

96孔板中種植密度為2×103個(gè)的MDA-MB-231細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度(0、2、4、8 mg/mL)槐耳顆粒的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，每孔中加入10 μL的CCK-8及190 μL完全培養(yǎng)基，37℃孵育2小時(shí)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度(optical density，OD)值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%，孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活性，繪制抑制曲線圖。

1.4 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測(cè)

75 mL培養(yǎng)瓶中種植密度為1.0×105的MDA-MB-231細(xì)胞/瓶，貼壁后加入含不同濃度(0、2、4、8 mg/mL)槐耳顆粒的培養(yǎng)基5 mL培養(yǎng)48小時(shí)。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，加入適量胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，1000 r/分鐘離心5分鐘，棄上清，使用預(yù)冷的PBS清洗3次，3000 r/分鐘離心后收集細(xì)胞沉淀，每組細(xì)胞沉淀后加入含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液100 μL，在冰上裂解細(xì)胞30分鐘，手持式超聲儀超聲10秒。裂解后12000 r/分鐘離心收集上清，聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)法蛋白定量后將蛋白濃度調(diào)至1.5 μg/μL，加5×loading buffer，沸水煮10分鐘。用SDS-PAGE凝膠電泳(100 V，1小時(shí)30分鐘)，轉(zhuǎn)膜(206 mA，2小時(shí)15分鐘)，封閉1小時(shí)， 4 ℃水平搖床一抗(PI3K p85，1∶10000；mTOR，1∶10000；Akt，1∶10000；GAPDH，1∶40000)孵育過(guò)夜。TBST 緩沖液洗滌后加入二抗(1∶10000)孵育，洗滌，配制化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)與膜共同孵育30秒，化學(xué)發(fā)光成像儀自動(dòng)曝光，Image QuantTmlAS-4000Mini Imager攝片，ImageJ180分析量化條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)蛋白的含量。

1.5 Tunel熒光染色及定量分析

12孔板中加入細(xì)胞爬片，種植密度為1.0×105MDA-MB-231細(xì)胞/孔，貼壁后，加入含不同濃度(0、2、4、8 mg/mL)槐耳顆粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)。4%多聚甲醛固定1小時(shí)，PBS溶液清洗3次。0.1%曲拉通4℃通透20分鐘，PBS清洗3次。從標(biāo)記液中取100 μL作為兩個(gè)陰性對(duì)照，然后將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)溶液50 μL加入到剩下的標(biāo)記液450 μL中，混勻。在細(xì)胞爬片加50 μL熒光標(biāo)記液，37℃避光孵育60分鐘，用PBS洗滌3次，含0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染后抗熒光淬滅封片劑封片，觀察染色情況。使用ImageJ180進(jìn)行定量Tunel染料熒光強(qiáng)度分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡的強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 槐耳顆粒濃度與MDA-MB-231細(xì)胞活力的關(guān)系

本研究測(cè)量不同濃度(0、2、4、8 mg/mL)、不同時(shí)間(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))下槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響，并采取人正常乳腺上皮細(xì)胞(MCF10A細(xì)胞)作為對(duì)照，采用CCK-8方法進(jìn)行測(cè)定。與空白對(duì)照(濃度為0 mg/L)相比，槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231活力的抑制呈濃度依賴及時(shí)間依賴，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且對(duì)MCF10A細(xì)胞的活力呈促進(jìn)作用，無(wú)濃度依賴，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 不同濃度、不同時(shí)間槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的影響

表2 不同濃度槐耳顆粒處理48小時(shí)對(duì)MDA-MB-231及MCF10A細(xì)胞影響的對(duì)比

2.2 不同濃度槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

為了驗(yàn)證槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，將不同濃度的槐耳顆粒與MDA-MB-231細(xì)胞共同孵育24小時(shí)，使用熒光Tunel試劑盒對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行孵育。經(jīng)熒光顯微鏡分析提示，與空白對(duì)照(濃度為0 mg/L)相比，槐耳顆?？纱龠M(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，當(dāng)濃度達(dá)到8 mg/L時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

注：圖中綠色熒光為陽(yáng)性表達(dá)。

表3 不同濃度槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度表達(dá)的影響

2.3 不同濃度槐耳顆粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR的影響

使用Western blot檢測(cè)經(jīng)不同濃度槐耳顆粒處理后的MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、mTOR的表達(dá)。與空白對(duì)照(濃度為0 mg/L)相比，槐耳顆?？梢韵抡{(diào)MDA-MB-231中PI3K及Akt的水平，且呈濃度依賴型，而mTOR的水平相較空白對(duì)照也有一定下調(diào)，但4 mg/mL為最佳作用濃度。結(jié)果表明，槐耳顆?？梢韵抡{(diào)MDA-MB-231細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中與腫瘤增殖相關(guān)的關(guān)鍵蛋白PI3K p85、Akt，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。見(jiàn)表4、圖2。

表4 不同濃度槐耳顆粒處理的MDA-MB-231細(xì)胞的PI3K、Akt、mTOR表達(dá)比較

注： A濃度0 mg/L；B濃度2 mg/L；C 濃度4 mg/L；D濃度8 mg/L。

3 討論

槐耳顆粒主要成分為槐耳多糖，其主要藥理學(xué)作用為在既往的多中心隨機(jī)對(duì)照研究中，槐耳顆粒被證實(shí)可降低肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率[3-4]，盡管該藥物在臨床中已作為三陰性乳腺癌化學(xué)治療的輔助藥物，但其作用機(jī)理尚不明確[5-6]。在既往研究中，槐耳顆粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞CXC趨化因子配體1(CXC chemokine ligand 1，CXCL1)表達(dá)的抑制可降低細(xì)胞的侵襲作用[7]，且可降低乳腺癌動(dòng)物模型KI-67、p53、Her-2的表達(dá)[8]。在本研究中，隨著槐耳顆粒給藥濃度的上升，PI3K p85及Akt的表達(dá)均出現(xiàn)下降，且呈濃度依賴性，提示槐耳顆粒對(duì)PI3K及其下游蛋白的活性Akt起到抑制作用。除此之外，隨時(shí)間、給藥濃度的上升，三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的活性出現(xiàn)不同程度的下降，細(xì)胞凋亡的水平出現(xiàn)不同程度上升，這表明槐耳顆粒對(duì)PI3K的影響可能是進(jìn)一步影響MDA-MB-231細(xì)胞的活性并促進(jìn)凋亡的原因。

目前三陰性乳腺癌被分為不同的亞型，包括管腔雄激素受體型(luminal androgen receptor，LAR)、基底樣型(basal-like，BL)、間充質(zhì)型(mesenchymal，MES)以及免疫調(diào)節(jié)型/免疫激活型(immunomodulatory/basal-like immune-activated，IM/BLIA)等[9]，其中MES型三陰性乳腺癌的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白具有高畸變率，因此PI3K/Akt/mTOR抑制劑已明確對(duì)MES型三陰性乳腺癌有效，而這一分型占三陰性乳腺癌的70%[10]。不僅如此，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路廣泛存在于體細(xì)胞中，是影響多種生理活動(dòng)的重要信號(hào)通路。其中PI3K由p85調(diào)節(jié)亞基及p110催化亞基組成，p85亞基通過(guò)調(diào)節(jié)催化亞基的穩(wěn)定性，構(gòu)象和定位來(lái)控制PI3K的激活[11]。盡管越來(lái)越多的研究認(rèn)為p85α及p85β在腫瘤進(jìn)展中具有相反的功能[12-13]，但p85的表達(dá)仍舊為PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因素。PI3K的激活進(jìn)一步影響Akt及mTOR的激活，并使該信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)增殖、抑制細(xì)胞凋亡及分化異常，促進(jìn)腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移的作用。目前上市藥物有廣譜型PI3K抑制劑、亞型特異性PI3K抑制劑、PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑等[14]，但均存在不同問(wèn)題，如廣譜性PI3K抑制劑適應(yīng)癥不包括三陰性乳腺癌[15-16]，尚不能確定對(duì)三陰性乳腺癌的療效；PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑存在耐藥性高、不良反應(yīng)嚴(yán)重等問(wèn)題[17]，因此，可靠的替代方案仍舊是三陰性乳腺癌治療中的難點(diǎn)熱點(diǎn)?；倍w粒在本研究中對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖存在一定抑制作用，作為中藥單藥制劑，其主要不良反應(yīng)為惡心、嘔吐，相較傳統(tǒng)PI3K或PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑具有不良反應(yīng)更小的特點(diǎn)，這為該藥應(yīng)用于難治性三陰性乳腺癌作為備選藥物提供了可能性。

綜上所述，槐耳顆粒在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的抑制作用類似于PI3K抑制劑，這可能為三陰性乳腺癌多重耐藥及挽救治療提供了一個(gè)可行的思路。本研究?jī)H進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，主要不足為槐耳顆粒對(duì)三陰性乳腺癌的抑制作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。