夏 葉,李春華,孫瑩慧,朱永軍,繆德年*,辛永萍
(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院,浙江 杭州 310009)
單核細胞增生李斯特菌(簡稱單增李斯特菌,Listeria monocytogenes,Lm),是一種嚴重危害健康的食源性人獸共患致病菌,可通過多種途徑傳播,引起人和動物的感染,出現(xiàn)胃腸炎、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等癥狀,致死率可達20%~30%,與大腸桿菌O157、沙門菌以及空腸彎曲桿菌并稱世界4 大食源性病原菌,被WHO 列為必檢的食源性致病菌[1-3]。Lm 的致病性與其強大的抗應激能力密不可分,該菌可在高滲透壓(10%~20%NaCl)、低溫高溫(0.4 ℃~45 ℃)以及寬泛的pH(pH2.5~pH9.0)條件中生長,從而使其廣泛存在于自然界、食品加工及儲存環(huán)境中[4]。
細菌在遭遇應激或環(huán)境變化時,會啟動相應的抗應激機制來適應環(huán)境并抵抗應激。革蘭氏陽性菌中,Sigma B(σB)作為最重要的應激調(diào)控因子,直接或間接參與細菌的抗應激過程[4-6]。σB首先在枯草芽胞桿菌中被發(fā)現(xiàn)[7],而其活性也受到調(diào)控操縱子(Rsbs)的精密調(diào)控[8]。該調(diào)控操縱子由7 個基因組成:rsbR、rsbS、rsbT、rsbU、rsbV、rsbW和rsbX,sigB位于rsbW之后、rsbX之前。σB操縱子上游的rsbR、rsbS和rsbT 編碼的蛋白構成應激復合體RsbRRsbS-RsbT,穩(wěn)定整個抗應激系統(tǒng)。RsbS 作為復合體中的骨架蛋白,其磷酸化/非磷酸化狀態(tài)在σB抗應激激活過程中至關重要[9]??莶菅堪麠U菌和Lm 中的RsbS 較保守,二者同源性高達74.1%,但其在Lm中發(fā)揮的抗應激機制尚無報道。本研究通過原核表達系統(tǒng)獲得重組RsbS 蛋白并純化后,免疫BALB/c 小鼠,制備RsbS 多克隆抗體,生物信息學預測其理化特性和潛在磷酸化位點,進行蛋白互作篩選,并通過Lm 野生株10403S 和缺失株ΔrsbR分析RsbS 參與的抗應激機制,以期為研究RsbS 蛋白的生物學功能及其在Lm 抗應激過程中發(fā)揮的作用奠定基礎。
1.1 主要實驗材料及實驗動物Lm 野生型菌株10403S、缺失株ΔrsbR[10]、大腸桿菌DH5α 和Rosetta(DE3)、原核表達質(zhì)粒pET-30a、RsbR 蛋白[10]、RsbX蛋白及10403S 全菌蛋白[11]均由本實驗室保存。
腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自北京陸橋技術股份有限公司;酵母浸膏、胰蛋白胨、卡那霉素(工作濃度為50 μg/mL)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA 連接酶、BCA 蛋白定量試劑盒和HRP 標記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)購自生工生物工程(上海)有限公司;2×PCR Mix、高保真酶2×phanta Max Master Mix、DNA 膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、RNA 抽提試劑盒、反轉錄試劑盒以及SYBR Green 購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA Marker 購自北京全式金生物技術有限公司;限制性內(nèi)切酶和蛋白Marker 購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司;核酸電泳染料Goldview 購自上海賽百盛基因技術有限公司;His-Ni 純化柱購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
6 周齡~8 周齡BALB/c 小鼠(18 g~22 g,雌性)購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心。
1.2 RsbS 蛋白的理化特性分析通過ExPAsy 服務器(https://web.Expasy.org/protparam/)分析RsbS 蛋白的理化性質(zhì)。利用NetPhos 3.1 服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測RsbS 蛋白潛在的磷酸化位點。采用SWISS-MODEL 在線軟件預測RsbS 蛋白的三級結構。
1.3 rsbS基因的PCR 擴增與重組RsbS 蛋白的表達根據(jù)Genbank 中登錄的Lm 10403S 株全基因組序列(CP002002.1),通過Vector NTI 軟件設計針對rsbS基因完整ORF 片段的引物并引入酶切位點,F(xiàn):5'-CGGGATCCGTGGGGATACCAATCTTAAAGTTAG G(BamH I)-3'/R:5'-CGGTCGACTCATTCCCCCAATT CCTGTTTAAG(SacI)-3',預期目的片段大小為373 bp。引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。采用熱裂解法提取Lm10403S 株的基因組DNA[12]并作為模板,PCR 擴增rsbS基因。PCR 反應條件:95 ℃30 s; 95 ℃10 s, 55 ℃30 s,72 ℃30 s,35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。rsbS基因的PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和SacI 雙酶切,回收后克隆于經(jīng)同樣酶切處理的pET-30a(+)中,轉化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞,經(jīng)菌液PCR 檢驗呈陽性的樣品由鉑尚生物技術(上海)有限公司測序鑒定。將無氨基酸突變的陽性克隆轉化入表達菌株Rosetta(DE3)中,經(jīng)PCR鑒定正確的重組表達菌命名為pET-30a-rsbS/Rosetta。
將重組表達菌pET-30a-rsbS/Rosetta 37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600nm約0.5,加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG 誘導培養(yǎng)后,以8 000 r/min 離心10 min 收集菌體,超聲裂解后分別收集上清和沉淀(沉淀用含8 mol/L 尿素的PBS 充分溶解),通過SDSPAGE 檢測重組RsbS 蛋白表達情況,進一步利用His-Ni 純化柱對重組RsbS 蛋白進行純化,采用BCA方法測定蛋白濃度,用于后續(xù)試驗。
1.4 蛋白互作的等溫滴定量熱分析根據(jù)GE 公司ITC200 微量等溫滴定量熱儀的操作指南,通過等溫滴定量熱試驗進行RsbS 蛋白與其上游蛋白RsbR 的互作試驗。參照肖雨涵等的方法對1.3 中純化的重組蛋白進行透析[13],以減少溶劑中的雜質(zhì)在滴定過程中可能引起的熱效應變化。滴定蛋白(RsbS)與被滴定蛋白(RsbR)濃度比為5∶1,RsbS 蛋白單次滴定體積10 μL,滴定速度2 s/μL,滴定間隔300 s,攪拌速度300 r/min,反應溫度25 ℃。實驗結果利用NanoAnalyze 軟件進行independent 和blank(constant)擬合,通過計算結合位點數(shù)(n)、親和力常數(shù)(Ka)、熔變(ΔH)、熵變(ΔS)等熱力學參數(shù)來判斷蛋白間的互作關系。
1.5 RsbS 多克隆抗體的制備及鑒定將純化的重組RsbS 蛋白作為抗原,與弗氏完全佐劑等體積混合,采用注射推拉法充分乳化至油包水狀態(tài),于小鼠脊椎兩側經(jīng)皮下多點注射。免疫前經(jīng)尾靜脈采血作為陰性對照,每10 d 免疫一次。初免抗原量為200 μg/只,二免、三免和四免抗原量均為100 μg/只。四免后一周眼眶采集血,分離血清后,3 000 r/min 離心20 min,收集上清即為RsbS 多克隆抗體。將純化的重組RsbS 蛋白以每孔3 μg 的量包被于96 孔聚乙烯酶標板,以2 倍倍比稀釋的RsbS 多抗(1∶500~1∶256 000)作為一抗,羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)作為二抗,采用間接ELISA 測定抗體效價。當OD450nm值>0.2,且P/N≥2.1 時的最大抗體稀釋倍數(shù)即為其效價。參照文獻中western blot 方法鑒定RsbS 多抗的反應原性[11]。即以RsbX 蛋白和空載體pET-30a/Rosetta裂解液作為陰性對照,檢測制備的RsbS 多克隆抗體能否與Lm10403S 全菌蛋白中的RsbS 蛋白特異性結合。鑒定正確后的多克隆抗體用于后續(xù)研究RsbS 參與細菌抗應激反應的機制。
1.6 應激狀態(tài)下Lm 野生菌株與缺失菌株rsbS基因轉錄水平的分析將培養(yǎng)至OD600nm約0.6 的Lm 野生株10403S 和缺失株ΔrsbR分別用BHI 液體培養(yǎng)基(pH7.4)和含5% NaCl 的BHI 應激培養(yǎng)基于37 ℃震蕩培養(yǎng)30 min 后,離心收集菌體。根據(jù)說明書抽提全菌RNA 并逆轉錄成cDNA 后,參照本實驗室建立的方法[11],利用qPCR 分別檢測野生株和缺失株中rsbS(F:5'-AAACGTCGGCCAGAGGAGTA-3'/R:5'-CTTT TGCACCCATTAGTTTAGACAT-3')在應激/非應激狀態(tài)下的轉錄水平。以gyrB(F:5'-AGACGCTATTGA TGCCGATGA-3'/R:5'-GTATTGCGCGTTGTCTTCGA-3')作為內(nèi)參[11],以BHI 液體培養(yǎng)的非應激組作為對照組,利用2-ΔΔCT法分析rsbS基因的轉錄水平。
1.7 應激狀態(tài)下Lm 野生菌株與缺失菌株RsbS 蛋白表達量分析將培養(yǎng)至OD600nm約0.6 的Lm 野生株10403S 和缺失株ΔrsbR分別用BHI 液體培養(yǎng)基和含5% NaCl 的BHI 應激培養(yǎng)基于37 ℃震蕩培養(yǎng)30 min后,離心收集菌體,超聲裂解收獲全菌蛋白。利用western blot 鑒定野生株和缺失株中RsbS 蛋白在應激/非應激狀態(tài)下的表達量差異,以RsbS 多克隆抗體作為一抗(1∶500),羊抗鼠IgG-HRP 作為二抗(1∶5 000),GAPDH 作為內(nèi)參蛋白,利用Quantity One 軟件進行定量分析。
2.1 RsbS 蛋白的理化特性分析經(jīng)ExPAsy 服務器分析顯示,Lm RsbS 蛋白分子式為C565H938N136O175S4,含有118 個氨基酸,亮氨酸含量最高為13.6%,異亮氨酸含量次之為12.7%,不含天冬氨酸、色氨酸和酪氨酸。RsbS 蛋白帶正電荷殘基8 個,負電荷殘基18 個,等電點為4.38。RsbS 蛋白在體外的理論半衰期為100 h,不穩(wěn)定系數(shù)為32.55,表明該蛋白較為穩(wěn)定。RsbS 蛋白的平均親水指數(shù)(GRAVY)為0.625,預測其在胞外的可能性較高,表明該蛋白具有較高親水性。NetPhos 3.1 服務器分析顯示,RsbS蛋白共有8 個潛在的磷酸化位點,分別為S18、T24、S40、S56、S69、T88、S101 和S107,提示該蛋白可能易被磷酸化。經(jīng)SWISS-MODEL 在線軟件同源建模的方法預測RsbS 蛋白三級結構(圖1)。RsbS 蛋白序列與SWISS-MODEL 中作為模板的序列枯草芽孢桿菌RsbS 蛋白的一致性高達73.28%,GMQE值0.77,QMEAN 值-0.51,表明預測的三級結構可靠性高,基本可代表RsbS 蛋白的真實狀態(tài),提示Lm RsbS蛋白可能與枯草芽胞桿菌RsbS 蛋白一樣參與細菌的應激調(diào)控。
圖1 Lm RsbS蛋白三級結構預測Fig.1 Protein tertiary structure prediction of Listeria monocytogenes RsbS
2.2 重組表達質(zhì)粒及重組RsbS 蛋白表達的鑒定結果以構建的重組質(zhì)粒為模板擴增rsbS基因,目的條帶與預期373 bp 大小相符(圖2),表明重組表達質(zhì)粒pET-30a-rsbS正確構建。測序鑒定結果顯示擴增的rsbS基因未發(fā)生突變。
圖2 重組質(zhì)粒pET-30a-rsbS的PCR鑒定結果Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET-30a-rsbS
重組表達菌pET-30a-rsbS/Rosetta 經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG 誘導表達3 h 后,收集裂解菌體的上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE 檢測。結果顯示,重組菌的上清和沉淀中均在18.8 ku 處出現(xiàn)目的條帶,與重組RsbS蛋白預期大小一致,而空載體菌對照樣品未出現(xiàn)相應條帶;重組RsbS 蛋白在上清和沉淀中均有表達,上清中的蛋白量略高于沉淀中的蛋白;利用His-Ni純化柱對重組RsbS 蛋白進行親和層析純化,SDSPAGE結果顯示蛋白純化效果較好(圖3)。BCA方法檢測純化蛋白濃度約1 μg/mL。結果表明,獲得的重組RsbS蛋白具有良好的純度和濃度,可用于后續(xù)試驗。
圖3 重組RsbS蛋白表達及純化的SDS-PAGE檢測結果Fig.3 SDS-PAGE identification of expression and purification of recombinant RsbS protein
2.3 蛋白互作的等溫滴定量熱分析蛋白質(zhì)間發(fā)生生化反應均會有一定程度的熱量改變,等溫滴定量熱法是近年發(fā)展起來的用于研究生物分子間相互作用的重要技術,可靈敏的捕捉反應體系中的熱量變化,通過監(jiān)測體系中的熱量變化確定蛋白間是否發(fā)生相互作用。利用NanoAnalyze 軟件繪制RsbS 與RsbR蛋白互作的等溫滴定量熱曲線并計算熱力學參數(shù)。圖4 上半部分顯示了RsbS 蛋白每次滴入RsbR 蛋白溶液中,反應體系所吸收的熱量值,將上半部分圖中每個峰的峰面積積分值對RsbS 與RsbR 的摩爾比作圖(所有數(shù)據(jù)均已扣除背景滴定),即得出圖4 下半部分的擬合曲線。圖4 結果顯示,每10 μL RsbS 蛋白滴定入RsbR蛋白,體系均發(fā)生了1.67 μW~3.35 μW的能量變化,對應產(chǎn)生的摩爾熱量約為1 100 kJ/mol~2 206 kJ/mol,表明RsbS 與RsbR 蛋白間發(fā)生了反應,導致體系產(chǎn)生了熱量變化。利用NanoAnalyze軟件計算得到RsbS 與RsbR 蛋白互作的熱力學參數(shù)為:結合位點數(shù)n=3.43、親和力常數(shù)Ka 為1.48×1012L/mol、ΔH1.16×103kJ/mol、ΔS4.13 kJ/mol/K。根據(jù)蛋白互作的熱力學規(guī)律可初步判斷[14]:RsbS 與RsbR 間的互作為吸熱反應,兩個蛋白間存在至少3個結合位點,ΔS>0 且ΔH>0 表明該兩個蛋白間的互作是由疏水力作用主導,提示RsbS 與RsbR 蛋白在體外存在互作。
圖4 RsbS與RsbR互作的等溫滴定量熱曲線Fig.4 Isothermal titration calorimetry curve of RsbS-RsbR binding
2.4 RsbS 多克隆抗體效價和反應原性鑒定結果將純化的重組RsbS 蛋白經(jīng)4 次免疫小鼠后,收獲血清,間接ELISA 測定RsbS 多克隆抗體效價約1∶128 000(圖5A)。經(jīng)western blot 檢驗該多克隆抗體的反應原性,結果顯示,Lm10403S 全菌蛋白在18.8 ku 處出現(xiàn)特異性條帶,陰性對照RsbX 蛋白及空載體菌pET-30a/Rosetta 裂解液均未見反應條帶(圖5B)。表明獲得的RsbS 多克隆抗體具有良好的反應原性,可以用于后續(xù)試驗。
圖5 RsbS多克隆抗體效價的測定(A)及western blot(B)檢測結果Fig.5 Titer(A)and western blot(B)detection of RsbS polyclonal antibody
2.5 rsbS在應激條件下的轉錄水平分析利用qPCR檢測Lm 野生株和缺失株在NaCl 應激條件下rsbS基因的轉錄水平。結果顯示,5%NaCl 應激30 min 后,野生株10403S 中rsbS基因的轉錄水平顯著增高,約為未應激對照組的2.10 倍(P<0.01);而缺失株ΔrsbR中rsbS基因的轉錄水平降低,約為對照組的61%(P<0.05),具有統(tǒng)計學差異(圖6)??梢?% NaCl 應激會刺激LmrsbS基因的轉錄水平增高,提示該基因可能具有抗?jié)B透壓應激的功能;但缺失株ΔrsbR中rsbS基因在5% NaCl 應激條件下的轉錄水平降低,提示rsbS基因的抗?jié)B透壓應激功能可能受rsbR基因的調(diào)控。表明rsbS基因通過rsbR基因的介導而參與抗應激反應。
圖6 Lm 10403S和ΔrsbR中rsbS基因在NaCl應激和未應激(pH7.4)條件下的轉錄水平差異Fig.6 Transcription difference of Listeria monocytogenes 10403S and ΔrsbR rsbS gene under NaCl stress or unstress(pH7.4)condition
2.6 RsbS 在應激條件下的表達量分析利用本研究制備的RsbS 多克隆抗體經(jīng)western blot 檢測Lm 野生株和缺失株在NaCl 應激條件下RsbS 蛋白的表達量。結果顯示,5% NaCl 應激30 min 后,野生株10403S中RsbS 蛋白的表達量增高,約為對照組的1.53 倍(P<0.05),具有統(tǒng)計學差異(圖7A、7B);缺失株ΔrsbR中RsbS 蛋白的表達量降低,約為對照組的51%(P<0.05),具有統(tǒng)計學差異(圖7C、7D)。可見5%NaCl 應激會刺激Lm RsbS 蛋白的表達量增高,提示RsbS 蛋白可能參與Lm 抗?jié)B透壓應激的過程;但rsbR缺失的情況下,RsbS 蛋白在5% NaCl 應激條件下的表達量降低,提示RsbS 的抗?jié)B透壓應激作用可能需要RsbR 蛋白的協(xié)同參與。進一步驗證RsbS 通過與RsbR蛋白互作參與抗應激反應。
圖7 Lm 10403S(A、B)和ΔrsbR(C、D)中RsbS蛋白在NaCl應激和未應激(pH7.4)條件下的表達量差異Fig.7 Expression difference of Listeria monocytogenes 10403S(A,B)or ΔrsbR(C,D)RsbS protein under NaCl stress or unstress(pH7.4)condition
Lm 擁有強大的抗應激能力,σB作為該菌最重要的應激調(diào)控因子,其活性受到7 個調(diào)控操縱子(Rsbs)的精密調(diào)控。其中,RsbS 作為整條應激調(diào)控通路中的開關蛋白,其生物學功能及其在抗應激過程中發(fā)揮的作用具有重要的研究價值。
本研究通過生物信息學預測RsbS 蛋白的理化特性、三級結構和磷酸化位點,發(fā)現(xiàn)其與SWISSMODEL 中的模板序列枯草芽孢桿菌RsbS 蛋白的一致性高達73.28%,提示Lm RsbS 蛋白可能與枯草芽胞桿菌RsbS 蛋白擁有類似的應激調(diào)控功能[15]。本研究利用等溫滴定量熱技術對與RsbS 的互作蛋白進行了篩選和鑒定,發(fā)現(xiàn)Lm RsbS 與RsbR 蛋白存在互作反應,且兩個蛋白間至少存在3 個結合位點。該結果與Reeves 等利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證的枯草芽胞桿菌RsbR-RsbS應激復合體相類似[16],與Dessaux等提出的滲透壓應激中Lm可能瞬時存在RsbR-RsbS-RsbT復合體的假設相一致[6]?;蛟趹顟B(tài)下的轉錄和表達水平通常與其抗應激功能密切相關。進一步利用qPCR 和western blot 技術,分別對Lm 野生株和ΔrsbR缺失株在NaCl 應激條件下rsbS的轉錄和表達水平進行分析:檢測到NaCl 應激條件下,Lm 野生株中rsbS的轉錄和表達水平增高,表明RsbS 蛋白通過提高表達量正向參與了Lm 的抗?jié)B透壓應激過程,本研究首次對Lm 應激狀態(tài)下的rsbS水平進行了分析,所得結果與枯草芽胞桿菌RsbS 為應激正調(diào)控因子的結論一致[17];而缺失株ΔrsbR在NaCl 應激條件下rsbS的轉錄和表達水平均降低,提示RsbS 蛋白可能通過RsbR 的介導參與Lm 的抗?jié)B透壓應激過程,該結果進一步驗證了RsbR-RsbS 蛋白互作的結論,即在RsbR 缺失的情況下,RsbS 的應激應答水平降低,提示RsbS 的抗應激功能需在RsbR 的協(xié)同作用下才能發(fā)揮。枯草芽胞桿菌RsbR-RsbS 應激體協(xié)同作用從而激發(fā)細菌應激應答的觀點已被多次驗證[15-19],然而在Lm 中RsbR-RsbS 應激體的研究仍處于起步階段。綜上,推測RsbS 蛋白調(diào)控Lm 的抗應激過程是一個較為復雜的多元調(diào)控方式,可能涉及到多個蛋白的互作和應激應答,且生物信息學預測RsbS 蛋白具有8 個潛在磷酸化位點,因此RsbS 是如何與互作蛋白協(xié)同作用從而直接或間接影響Lm 的應激應答,以及影響互作的關鍵磷酸化位點有哪些?還需要進一步研究。
本研究獲得了Lm 重組RsbS 蛋白及其多克隆抗體,首次驗證了其RsbS 與RsbR 蛋白的體外互作,分析了rsbS在NaCl 應激條件下的轉錄和表達水平,為探明Lm RsbS 蛋白的生物學功能奠定基礎,為闡明RsbS 在應激調(diào)控中發(fā)揮的作用及Lm 的抗應激調(diào)控機制提供了重要基礎和研究工具。