劉延霞 楊 青 王紅怡 林則彬 汪婧怡（海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科，?？?571100）

小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（juvenile rheumatoid arthritis，JRA）是小兒時(shí)期常見的以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主的全身性結(jié)締組織病，是小兒致殘的重要原因，其病因尚未完全明確［1］?；こ衫w維細(xì)胞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）炎性增生滑膜中的主要細(xì)胞類型，滑膜成纖維細(xì)胞活化后，其增殖、遷移及侵蝕能力增強(qiáng)，可侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨組織，導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，因此，抑制滑膜成纖維細(xì)胞異常增殖、遷移和侵襲對(duì)防治RA 具有重要意義［2］。lncRNA 可通過影響滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明LINC01419在胃癌、肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高，抑制其表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移［3-5］。然而LINC01419對(duì)小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中miR-320a 的表達(dá)水平低于健康人，miR-320a 高表達(dá)可抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡［6］。miR-320a上調(diào)可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的激活、遷移和侵襲［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC01419 對(duì)小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制是否與miR-320a有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 取2017 年1 月至2019 年12 月本院收治的21 例小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織，其中男13 例，女8 例，年齡4～13 歲；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的診斷根據(jù)1987 年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的標(biāo)準(zhǔn)。取21 例因骨折或創(chuàng)傷截肢者的膝關(guān)節(jié)正?；そM織作為對(duì)照，其中男14 例，女7 例，年齡5～16歲；所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑 胎牛血清、DEME 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司；Trizol 試劑、cDNA 合成試劑盒、RT-qPCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；MTT 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 購自美國BD 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）取小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織標(biāo)本，用PBS 沖洗干凈，無菌條件下剪碎用胰蛋白酶于37℃充分消化，200 目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm，收集細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取3～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組 將si-NC、si-LINC01419、pcDNA、pcDNA-LINC01419、miR-NC、miR-320a 轉(zhuǎn)染至RASFs 中，記為si-NC 組、si-LINC01419 組、pcDNA組、pcDNA-LINC01419 組、miR-NC 組、miR-320a 組；將si-LINC01419 分別與anti-miR-NC、anti-miR-320a共轉(zhuǎn)染至RASFs 中，記為si-LINC01419+anti-miRNC組、si-LINC01419+anti-miR-320a組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)LINC01419 和miR-320a 表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，按照試劑盒說明進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系：2 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl 無菌水；循環(huán)條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。LINC01419和miR-320a分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，LINC01419 正向引物序 列：5'-AGAACTGAGGTCCACTTTCTGG-3'，反 向引物序列：5'-GGTCCTTTGTCTGCAACGA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-CATCCTGGGCTACACTGAGC-3'，反向引物序列：5'-AGTGGTCGTTGAGGGCAA-3'；miR-320a 正向引物序列：5'-GGGCTAAAAGCT?GGGTTGA-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTC?GTGGAGT-3'；U6 正向引物序列：5'-GCTTCGGCAG?CACATATACT-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h 時(shí)，每孔分別加入20 μl 的MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，加入DMSO 150 μl，振蕩10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 收集各組細(xì)胞，取200 μl接種于Transwell小室上室，培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell 小室上室加入50 μl 基質(zhì)膠Matrigel，凝固后接種細(xì)胞，之后同細(xì)胞遷移操作。

1.2.6 Western blot 法檢測(cè)CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 試劑盒定量；進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，用Quantity One 軟件測(cè)定各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC01419 和miR-320a 的靶向關(guān)系 構(gòu)建LINC01419 野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-LINC01419 和MUT-LINC01419，用LipofectamineTM2000 將其分別與miR-NC 和miR-320a 共轉(zhuǎn)染至RASFs 中，按照說明書檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，即n=9。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜組織中的表達(dá) 與Con 組比較，RA 患者滑膜組織中LINC01419 表達(dá)水平升高，miR-320a 表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表1。

表1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜組織中的表達(dá)（，n=21）Tab.1 Expression of LINC01419 and miR-320a in synovial tissue of JRA（，n=21）

表1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜組織中的表達(dá)（，n=21）Tab.1 Expression of LINC01419 and miR-320a in synovial tissue of JRA（，n=21）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05.

2.2 抑制LINC01419 表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響 與si-NC 組比較，si-LINC01419 組LINC01419 表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，CyclinD1表達(dá)水平降低，p21 表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖1和表2。

表2 抑制LINC01419 表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響（，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表2 抑制LINC01419 表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響（，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.3 抑制LINC01419 表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與si-NC 組比較，si-LINC01419組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低，MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖2和表3。

表3 抑制LINC01419 表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表3 抑制LINC01419 表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

圖2 遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of migration and invasion-related proteins

2.4 LINC01419 靶向調(diào)控miR-320a 的表達(dá) Lnc?Base Predicted v.2 預(yù)測(cè)顯示LINC01419 的序列中含有與miR-320a互補(bǔ)的核苷酸序列（圖3）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組比較，miR-320a組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC01419 的細(xì)胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染MUT-LINC01419的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化（表4）。與pcDNA 組比較，pcDNALINC01419 組miR-320a 表達(dá)水平降低，與si-NC 組比較，si-LINC01419 組miR-320a 表達(dá)水平升高（P＜0.05，表5）。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.4 Dual luciferase report experiment（，n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.4 Dual luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

表5 LINC01419調(diào)控miR-320a的表達(dá)（，n=9）Tab.5 LINC01419 regulates expression of miR-320a（，n=9）

表5 LINC01419調(diào)控miR-320a的表達(dá)（，n=9）Tab.5 LINC01419 regulates expression of miR-320a（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

圖3 LINC01419 的序列中含有與miR-320a 互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC01419 contains a nucleotide sequence complementary to miR-320a

2.5 miR-320a 過表達(dá)對(duì)JRA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC 組比較，miR-320a 組miR-320a 表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平降低，p21表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖4和表6。

表6 miR-320a過表達(dá)對(duì)JRA滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.6 Effect of miR-320a overexpression on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表6 miR-320a過表達(dá)對(duì)JRA滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.6 Effect of miR-320a overexpression on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

圖4 miR-320a 過表達(dá)后JRA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Proliferation，migration and invasion related pro?tein expression of synovial formation in JRA after miR-320a overexpression

2.6 干擾miR-320a表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01419表達(dá)對(duì)JRA滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用與si-LINC01419+anti-miR-NC組比較，si-LINC01419+anti-miR-320a 組miR-320a 表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平升高，p21表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖5、表7。

圖5 增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expressions of proteins related to proliferation，migration and invasion

表7 干擾miR-320a表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01419表達(dá)對(duì)JRA滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用（，n=9）Tab.7 Interference with miR-320a expression reversed effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表7 干擾miR-320a表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01419表達(dá)對(duì)JRA滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用（，n=9）Tab.7 Interference with miR-320a expression reversed effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-LINC01419+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

3 討論

小兒類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是兒童常見風(fēng)濕性疾病，嚴(yán)重影響患兒身體健康。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以滑膜組織增生、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及軟骨和骨組織的破壞等為主要病理特征，研究表明成纖維樣滑膜細(xì)胞的異常激活在其發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用；靶向成纖維樣滑膜細(xì)胞的研究可為有效治療RA 提供新思路［8-9］。研究報(bào)道LINC01419 在肝癌組織及其細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［10］。LINC01419 介導(dǎo)miR-519a-3p/PDRG1 軸，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中LINC01419 表達(dá)水平升高；抑制LINC01419 表達(dá)，滑膜成纖維細(xì)胞活性降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平降低，p21 表達(dá)水平升高；表明抑制LINC01419 表達(dá)可抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明，miRNA 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞異常增殖的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［12］。已有研究表明上調(diào)miR-320a 可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的激活、遷移和侵襲［7］。還有研究報(bào)道塞來昔布治療后膝骨關(guān)節(jié)炎患者miR-320a 表達(dá)水平升高［13］。miR-320a 的過表達(dá)可能增強(qiáng)白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的軟骨降解因子［14］。miR-320a 通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中BMI-1 和runt相關(guān)基因2（RUNX2）的表達(dá)來預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎軟骨退化［15］。以上研究表明miR-320a 不僅影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，還影響骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。此外，癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞中miR-320a 過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中miR-320a 表達(dá)水平降低；過表達(dá)miR-320a 抑制了小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；與MENG 等［7］研究結(jié)果一致。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，LINC01419 靶向調(diào)控miR-320a的表達(dá)；且干擾miR-320a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01419表達(dá)對(duì)小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，抑制LINC01419 表達(dá)可能通過靶向上調(diào)miR-320a 抑制小兒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。