單 杉，陳婷婷，李 南，張勝男，杞 萌，汪子穎，魏 偉，孫嫵弋

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確損肝因素外，脂肪在肝臟堆積產(chǎn)生的以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要病變的臨床病理綜合征[1]。NAFLD的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)均逐年升高，預(yù)計(jì)將成為未來(lái)10年內(nèi)我國(guó)第一大慢性肝病和肝臟移植手術(shù)的首要病因，但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)獲批的針對(duì)NAFLD的治療藥物[2]。動(dòng)物模型是研究疾病的發(fā)病機(jī)制、疾病的治療靶點(diǎn)以及制定防治策略的重要手段，對(duì)探究其發(fā)病機(jī)制與藥理作用等均有重要意義。目前針對(duì)NAFLD模型研究不斷取得新進(jìn)展，但因其機(jī)制復(fù)雜，建立與人類NAFLD疾病進(jìn)程相類似的動(dòng)物模型，仍是亟待解決的難題。高脂飼料喂養(yǎng)是較為常用的造模方法[3]，但該方法誘導(dǎo)成模周期長(zhǎng)，而單純的化學(xué)誘導(dǎo)被認(rèn)為不能較好地?cái)M合人類NAFLD的發(fā)病機(jī)制。高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合化學(xué)藥物誘導(dǎo)可能成為誘導(dǎo)建立NAFLD的新思路方法，因此本文選用兩種方法建立NAFLD模型，觀察在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合注射低劑量四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)相較于單純的WD飼料喂養(yǎng)建立的NAFLD病理特征和發(fā)病特點(diǎn)，旨在為不同因素誘發(fā)的NAFLD的潛在發(fā)病機(jī)制及相關(guān)分子基礎(chǔ)研究提供理想可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠6-8周齡，♂，體質(zhì)量18-20 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所SPF屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(皖)2020-001。恒溫(20±2)℃及濕度(50±5)%。12 h晝夜交替光照，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分組。所有操作經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：LLSC202000794)。

1.2 主要試劑及儀器西方飲食(western diet，WD)飼料(Research diets，D12079B，批號(hào):21060103)購(gòu)自上海博奧派克生物科技有限公司，普通維持飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供(批號(hào):21013113)；CCl4溶液(上海凌峰化工有限公司)；血糖儀及血糖檢測(cè)試紙(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；油紅O粉末(北京索萊寶科技有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，T-CHO)生化試劑盒，購(gòu)自日本和光純藥株式會(huì)社；脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體，均購(gòu)自Affinity公司；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，全自動(dòng)生化分析儀3100(日本日立有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡DM4B(德國(guó)LEICA公司)；Infinite M1000 PRO 多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；BIO-RAD powerpack164-5070電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Image Quant化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型建立及處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周體征狀態(tài)恢復(fù)穩(wěn)定后，隨機(jī)分為三組：正常飼料(normal diet，ND)對(duì)照組、WD組、WD+CCl4組。ND組小鼠喂食普通維持飼料，WD組喂食WD飼料，WD+CCl4組在喂食WD飼料的基礎(chǔ)上，每周一次注射50 μL的CCl4油溶液。在造模后第6、11、16周，眼眶后靜脈叢取血并處死小鼠，2 500 r·min-1離心20 min收集血清，凍存于-80 ℃冰箱。取出肝臟稱重后，留取部分肝組織制作病理石蠟切片及冰凍切片，剩余肝組織凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2血糖檢測(cè)及肝指數(shù) 造模期間每周稱量一次小鼠體質(zhì)量，并記錄。每?jī)芍軝z測(cè)一次血糖。眼眶后靜脈叢取血并處死小鼠后，迅速取出完整肝臟并稱量，計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù)/mg·g-1=肝臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.3血清生化檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)造模第6、11、16周，小鼠血清中的ALT、AST、TG、T-CHO水平。

1.3.4肝組織HE染色 肝組織包埋、切片，石蠟切片于二甲苯溶液中脫蠟，依次用100%、95%、85%、70%的乙醇進(jìn)行水化，蘇木精染色5 min，流水洗去染料，0.1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化，流水沖洗約2 min，入伊紅染液中2 s，流水沖洗多余染料，依次經(jīng)70%、85%、95%、100%乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。于普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性、細(xì)胞形態(tài)改變以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.5肝組織油紅O染色 肝組織行冰凍切片后，復(fù)溫干燥10 min，蒸餾水或60%乙醇稍洗，后在油紅O工作液中避光孵育10-15 min，60%乙醇分化數(shù)秒，水洗1 min，蘇木精復(fù)染1-2 min，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，甘油明膠封片保存。顯微鏡下可觀察到脂滴呈橘紅色至鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.3.6ELISA檢測(cè)肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 稱取一定量肝組織，無(wú)菌生理鹽水研磨成10%的組織勻漿。在酶標(biāo)包被板上分別設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔。待測(cè)樣品孔每孔加樣品稀釋液40 μL和10 μL待測(cè)樣品。加入酶標(biāo)試劑100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗滌5次，加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)；450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度(OD)值。

1.3.7Western blot檢測(cè)FAS、α-SMA蛋白表達(dá) 肝組織剪碎研磨后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集裂解液，12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清，加入上樣緩沖液，配制10% SDS-PAGE凝膠，上樣電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST-脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TPBS洗3次，每次7 min。根據(jù)一抗來(lái)源種屬選擇辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育2 h，TPBS洗3次，每次7 min，化學(xué)成像發(fā)光系統(tǒng)顯影蛋白條帶，采用ImageJ軟件定量分析蛋白灰度值，計(jì)算各組目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值以反映各組目的蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體征狀況造模過(guò)程中ND組小鼠狀態(tài)均良好、食欲良好，活動(dòng)正常。喂食WD飼料組小鼠糞便顏色均偏淺黃。ND組小鼠活動(dòng)頻繁且反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤。WD組和WD+CCl4組小鼠隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，毛色灰暗且雜亂粗糙，皮毛日漸疏松且油膩。WD+CCl4組小鼠精神萎靡(Fig 1)。

Fig 1 Comparison of NAFLD mouse appearance induced by different methods

2.2 小鼠體重和血糖變化造模過(guò)程中，WD組小鼠體重在第13周開(kāi)始明顯快速增長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WD組小鼠表現(xiàn)出體重增加和肥胖，CCl4處理減輕了WD喂養(yǎng)引起的體重增加，造模第13周，WD+CCl4組小鼠體重較ND組略微升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 2A)。WD喂養(yǎng)的小鼠血糖在造模后第6周開(kāi)始升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WD+CCl4組小鼠血糖從造模第6周開(kāi)始即較對(duì)照組明顯升高，略高于WD組，差異無(wú)顯著性(Fig 2B)。

2.3 小鼠肝指數(shù)和血清生化指標(biāo)

2.3.1小鼠肝指數(shù)情況 Tab 1結(jié)果顯示，造模第6周時(shí)，WD+CCl4組小鼠肝指數(shù)較ND組和WD組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模第11周時(shí)，WD組、WD+CCl4組小鼠肝指數(shù)較ND組略微升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第16周，WD組、WD+CCl4組小鼠肝指數(shù)較ND組明顯升高(P<0.05)。

Fig 2 Body weight and blood sugar of NAFLD mice induced by different methods

Tab 1 Changes of liver index in NAFLD mice induced by

2.3.2小鼠血清ALT、AST水平 Tab 2結(jié)果表明，從造模第6周開(kāi)始，WD組和WD+CCl4組小鼠ALT含量即開(kāi)始升高，與ND組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且WD+CCl4組小鼠ALT高于WD組。Tab 3結(jié)果表明，造模第11周開(kāi)始，WD組AST活性較ND組明顯升高，且WD+CCl4組的AST升高更為明顯，與WD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 2 Changes of serum ALT in NAFLD mice induced by different methods n=5)

Tab 3 Changes of serum AST in NAFLD mice induced by different methods n=5)

2.3.3小鼠血清TG和T-CHO水平 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清TG、T-CHO含量。Tab 4結(jié)果表明，從造模后第11周開(kāi)始，WD組和WD+CCl4組小鼠血清TG水平明顯升高，與ND組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且WD+CCl4組小鼠TG水平高于WD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tab 5結(jié)果表明，從造模后第6周開(kāi)始，WD和WD+CCl4組小鼠血清T-CHO水平明顯上升，與ND組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第16周時(shí)，WD組T-CHO水平明顯高于WD+CCl4組(P<0.05)。

Tab 4 Changes of serum TG in NAFLD mice induced by different methods n=5)

Tab 5 Changes of serum T-CHO in NAFLD mice induced by different methods n=5)

2.4小鼠肝組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索呈放射狀排列，肝小葉和匯管區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞質(zhì)均勻且無(wú)脂肪變性。WD組小鼠第6周時(shí)出現(xiàn)少量脂肪空泡；至第11周時(shí)脂肪空泡增多，且肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，符合非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)特征，第16周時(shí)出現(xiàn)大泡性、小泡性混合脂肪變性，伴有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。WD+CCl4組小鼠第6周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等NAFL特征；造模后第11周，除混合脂肪變性外，開(kāi)始出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)氣球樣變性等病理表現(xiàn)；第16周時(shí)，出現(xiàn)大量大泡性脂肪空泡、氣球樣變性等非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatosis，NASH)典型表現(xiàn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步加重，并出現(xiàn)纖維間隔增厚(Fig 3A)。油紅O染色結(jié)果表明(Fig 3B)，WD組在造模后第6周開(kāi)始出現(xiàn)脂滴，至造模第11、16周進(jìn)一步加重，小鼠肝臟所含脂滴在第16周達(dá)到峰值。WD+CCl4組小鼠在造模后第6周，肝細(xì)胞內(nèi)即開(kāi)始出現(xiàn)大量脂滴，明顯高于ND組和WD組；造模后第16周脂滴相較于WD組有所減少，明顯高于ND組(Fig 3C)。

Fig 3 Histological features of liver in NAFLD mice induced by different methods n=5)

2.5 肝臟IL-1β、TNF-α、IL-6水平變化多項(xiàng)研究表明，TNF-α等炎性細(xì)胞因子在NAFLD患者中呈高水平，并在疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)疾病的進(jìn)一步發(fā)展[4]。為進(jìn)一步了解NAFLD不同階段炎癥因子水平的變化，ELISA法檢測(cè)了小鼠肝組織IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。結(jié)果表明(Fig 4)，WD組小鼠肝臟IL-1β水平自造模第6周即開(kāi)始明顯升高，IL-6、TNF-α水平在造模后第11周開(kāi)始明顯升高，與ND組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WD+CCl4組小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平自造模后第6周開(kāi)始持續(xù)升高，與ND組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從造模后第6周開(kāi)始，WD+CCl4組IL-6和TNF-α水平較WD組明顯升高；造模后第11周開(kāi)始，WD+CCl4組IL-1β水平明顯高于WD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 FAS、α-SMA蛋白水平變化綜合分析兩種造模方法在不同時(shí)間點(diǎn)的病理、生化、炎性細(xì)胞因子等各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果表明在第16周時(shí)，WD+CCl4組小鼠可進(jìn)展至NASH階段，出現(xiàn)纖維化；WD組進(jìn)展至NAFL階段，脂質(zhì)蓄積發(fā)揮主要作用。因此我們進(jìn)一步檢測(cè)第16周時(shí)脂肪合成關(guān)鍵酶FAS和纖維化相關(guān)蛋白α-SMA表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示(Fig 5)，與ND組比較，WD和WD+CCl4組FAS水平均明顯升高，與油紅O染色結(jié)果一致；WD組FAS的表達(dá)明顯高于WD+CCl4組。WD組α-SMA的表達(dá)與ND組比較，差異無(wú)顯著性；而WD+CCl4組α-SMA水平較ND組、WD組明顯升高(P<0.01)。

3 討論

NAFLD是以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，初級(jí)階段為NAFL，如未進(jìn)行有效的控制和治療，可進(jìn)一步發(fā)展為NASH、肝纖維化和肝硬化，甚至有部分患者會(huì)進(jìn)展至肝癌。已有研究表明，在NAFLD病程的初期NAFL階段，只要積極給予干預(yù)治療，NAFLD可以被逆轉(zhuǎn)；NASH是單純性脂肪肝向肝纖維化和肝硬化發(fā)展的重要階段，因此構(gòu)建能夠體現(xiàn)NAFLD全病程的動(dòng)物模型至關(guān)重要。動(dòng)物模型的成功建立是研究NAFLD發(fā)病機(jī)制，尋找潛在藥物作用靶點(diǎn)，研發(fā)抗NAFLD藥物的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。當(dāng)前NAFLD動(dòng)物模型的建立方法仍在進(jìn)一步摸索完善中，國(guó)內(nèi)外常用的NAFLD動(dòng)物模型有：營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性模型，包括高糖、高脂、膽堿缺乏等誘發(fā)模型[5]；化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型，包括CCl4、四環(huán)素、乙硫氨酸等[6]。常用的經(jīng)典方法是高脂飲食誘導(dǎo)[7]，但該方法耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，且較難進(jìn)展到NASH、肝纖維化等病理階段。甲硫氨酸膽堿缺乏飲食(MCD)造模時(shí)間短，在第8周即可進(jìn)展至NASH。但由于缺乏膽堿和蛋氨酸成分，不符合人類實(shí)際的飲食情況，且會(huì)導(dǎo)致模型動(dòng)物體重的嚴(yán)重下降，與人類的NAFLD發(fā)病機(jī)制差別較大[8]，基于該方法建立的模型被認(rèn)為不能較好擬合NAFLD患者的發(fā)病特點(diǎn)，且不能體現(xiàn)出NASH向肝纖維化和肝硬化的演變過(guò)程[9-10]。因此，建立一種符合人類NAFLD疾病進(jìn)程，且能縮短造模時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型至關(guān)重要。含有高脂肪、高果糖和高膽固醇的WD飼料被廣泛應(yīng)用于當(dāng)前的小鼠NAFLD模型的建立，WD飼料模擬了當(dāng)前人們的快餐飲食習(xí)慣。研究表明，單純的WD飼料喂養(yǎng)不能誘導(dǎo)小鼠進(jìn)展至嚴(yán)重的NASH和纖維化階段[11]。CCl4是一種特征明確的肝臟毒素，可直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝纖維化，一直以來(lái)被用以誘導(dǎo)建立肝損傷和肝纖維化模型[12-13]。也有研究表明，CCl4可以誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)NASH的典型病變氣球樣變性[14]，可在WD喂養(yǎng)誘導(dǎo)肝脂肪變性的基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)NAFLD疾病的發(fā)展。因此本實(shí)驗(yàn)考慮在高脂飲食的基礎(chǔ)上，聯(lián)合小劑量的CCl4誘導(dǎo)建立NAFLD模型，并與單純的WD喂養(yǎng)模型進(jìn)行比較。

Fig 4 Levels of IL-1β (A),IL-6 (B)and TNF-α (C)in liver homogenates of NAFLD mice induced by different methods n=5)

Fig 5 Changes of FAS and α-SMA protein expression in NAFLD mice on 16th week n=5)

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，單純WD喂養(yǎng)和WD聯(lián)合小劑量CCl4的方法均能成功建立NAFLD模型，在造模后不同時(shí)間點(diǎn)先后出現(xiàn)NAFLD不同疾病進(jìn)程標(biāo)志性病理特征。NAFLD疾病主要表現(xiàn)為肝臟的代謝紊亂，包括血糖、血清TG和T-CHO水平升高等。兩組模型組小鼠血糖在造模后第6周開(kāi)始出現(xiàn)升高，WD+CCl4組血糖升高更明顯，同時(shí)小鼠血清中TG和T-CHO含量明顯升高，提示小鼠肝臟出現(xiàn)代謝紊亂，同時(shí)油紅O染色結(jié)果也表明肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積。肝損傷標(biāo)志物ALT、AST水平明顯升高，WD+CCl4組小鼠升高更為明顯。病理結(jié)果顯示，WD組小鼠在造模后第11周出現(xiàn)NAFL階段的脂肪空泡，16周時(shí)炎癥和脂肪變性進(jìn)一步加重，F(xiàn)AS蛋白水平明顯高于ND組和WD+CCl4組，T-CHO水平也明顯升高。WD+CCl4組小鼠在造模后第6周開(kāi)始出現(xiàn)NAFL階段明顯的脂肪變性空泡；至第11周時(shí)，除脂肪變性空泡外，開(kāi)始出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氣球樣變性，提示NAFLD疾病在發(fā)生進(jìn)展；造模后第16周時(shí)，肝臟脂質(zhì)蓄積作用減弱，F(xiàn)AS蛋白水平低于WD組，而細(xì)胞氣球樣變性和炎癥進(jìn)一步加重，表現(xiàn)出典型的NASH病理特征。因此，與單純的WD喂養(yǎng)比較，WD+CCl4能夠在第16周誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)NASH，而單純喂養(yǎng)WD組小鼠表現(xiàn)出NAFL病理特征。

炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致NAFLD疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。研究報(bào)道，在NAFLD患者血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著上調(diào)[15]，在動(dòng)物模型中，3種炎性細(xì)胞因子的水平也呈現(xiàn)高水平[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單純的WD喂養(yǎng)比較，WD+CCl4在引起脂肪變性的基礎(chǔ)上,可導(dǎo)致更為嚴(yán)重的肝臟炎癥，肝組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高，并明顯高于WD組。與病理結(jié)果一致，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氣球樣變性更為嚴(yán)重。α-SMA是活化的肝星狀細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，活化的星狀細(xì)胞能夠促進(jìn)膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的生成，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[17]。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WD+CCl4組小鼠在造模后第16周α-SMA蛋白的表達(dá)水平明顯上升，高于ND組和WD組，結(jié)合HE染色結(jié)果該組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的膠原纖維增粗，提示該模型組小鼠出現(xiàn)纖維化。當(dāng)前學(xué)界較為認(rèn)可的NAFLD發(fā)病機(jī)制是“多重打擊學(xué)說(shuō)”，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為脂肪變性、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥等多重打擊平行作用于機(jī)體[18]，因此高脂飲食聯(lián)合化學(xué)誘導(dǎo)符合該學(xué)說(shuō)的理念。本研究中WD喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量的CCl4可誘導(dǎo)肝臟發(fā)生炎癥，并出現(xiàn)纖維化，導(dǎo)致疾病進(jìn)展至NASH階段。

綜上所述，高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合化學(xué)誘導(dǎo)有望成為新的高效的NAFLD造模方法，能夠彌補(bǔ)單純高脂飲食喂養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)的不足。本研究中，WD飼料喂養(yǎng)聯(lián)合每周一次小劑量CCl4腹腔注射能夠成功誘導(dǎo)建立小鼠NAFLD模型，符合人類NAFLD病理演變過(guò)程，可進(jìn)展至NASH甚至纖維化，是一種較為理想的小鼠NAFLD模型建立方法，為今后研究NAFLD提供更接近臨床發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物造模方法。