任曉霞，馬君義，鄭一丹，王 芃，陽志強(qiáng),3，李茂星

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院臨床藥學(xué)科，甘肅 蘭州 730050；3.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

高海拔和高山覆蓋了地球表面積的五分之一。隨著科技進(jìn)步和社會(huì)發(fā)展，越來越多的人進(jìn)入高海拔地區(qū)[1]。高海拔地區(qū)具有低壓缺氧、低溫低濕和強(qiáng)紫外線輻射等特點(diǎn)。其中，低壓缺氧影響最大[2]。當(dāng)長期處于低海拔地區(qū)的人們進(jìn)入到高海拔地區(qū)時(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)能力降低，組織氧化還原平衡發(fā)生紊亂，血腦屏障通透性增高，進(jìn)而誘發(fā)高原腦水腫(high altitude cerebral edema，HACE)。HACE是急性高原病的終末期，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[3]。目前，HACE的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，導(dǎo)致預(yù)防和治療HACE的方法受到限制。越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在高原相關(guān)疾病中起著至關(guān)重要的作用[4-5]。

貫葉金絲桃(HypericumperforatumL．)屬藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，又稱貫葉連翹，歐洲稱其為圣·約翰草(St John′s wort)，主要分布于我國河北、陜西、甘肅、山東、江蘇、新疆、四川等地。貫葉金絲桃具有抗抑郁、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗缺氧和促進(jìn)傷口愈合等藥理學(xué)作用，現(xiàn)已被中醫(yī)典籍及許多國家的藥典收錄，成為歐洲治療抑郁癥和東亞治療炎癥的首選藥物之一[6-7]。楊柳[8]通過測(cè)定大鼠血清中過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，表明貫葉金絲桃具有明顯的抗氧化能力。Gioti等[9]發(fā)現(xiàn)貫葉金絲桃黃酮類化合物的抗氧化機(jī)制可能與金屬螯合、自由基清除和活性氧淬滅等相關(guān)。黃酮類化合物金絲桃苷(hyperoside，HYP)、萘駢二蒽酮類化合物金絲桃素(hypericin)和間苯三酚類化合物貫葉金絲桃素(hyperforin)作為該植物的活性成分經(jīng)常被用作質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[10]。國內(nèi)對(duì)貫葉金絲桃的研究主要集中在活性成分的提取和分離，在藥理活性及其作用機(jī)制方面研究報(bào)道甚少。貫葉金絲桃預(yù)防和治療HACE的作用及其抗缺氧活性是否與炎癥相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)尚無報(bào)道。本研究采用大型低壓氧艙模擬海拔7 500 m的高原缺氧環(huán)境，建立缺氧大鼠HACE模型，通過對(duì)缺氧大鼠腦組織中氧化應(yīng)激與炎癥因子相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)探討貫葉金絲桃提取物(Hypericumperforatumextract，HPE)對(duì)缺氧大鼠HACE的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，Wistar健康♂大鼠80只，體質(zhì)量(180～220)g，由聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(軍)2017-0023。動(dòng)物飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，使用許可證號(hào)為SYXK(軍)2017-0047。飼養(yǎng)期間大鼠于室溫下自由攝食進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行，審批編號(hào)為2020KYLL064。

1.2 藥物與試劑貫葉金絲桃由甘肅省康縣福祥中藥材種植農(nóng)民專業(yè)合作社提供，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院李茂星主任藥師鑒定為藤黃科貫葉金絲桃干燥地上部分；D101型大孔吸附樹脂(天津海光，批號(hào)：160305)；地塞米松片(dexamethasone，DXM，浙江仙琚制藥，批號(hào)：200402)；羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na，國藥集團(tuán)，批號(hào)：20180412)；HYP(純度>98%，江蘇永健，批號(hào)：CX0012)；MDA(批號(hào)：A003-1-1)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2，批號(hào)：A064-1-1)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD，批號(hào)：A001-1-2)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH，批號(hào)：A006-1-1)和CAT(批號(hào)：A007-1-1)測(cè)定試劑盒均購自南京建成；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20200602)、大鼠白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β，批號(hào)：SEKR-0002)、白介素-6(interleukin-6，IL-6，批號(hào)：SEKR-0005)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，批號(hào)：SEKR-0032)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號(hào)：SEKR-0009)測(cè)定試劑盒均購自北京索萊寶。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器多功能動(dòng)態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)(上海矩源，JYT-50LN)；可調(diào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮，RE-52A)；冷凍干燥機(jī)(西班牙，Telster LyoQuest-55 plus)；模擬高原低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙群(貴州風(fēng)雷航空軍械，DYC-9070)；全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信，Tissuelyser-24)；制冰機(jī)(意大利斯科茨曼，AF-80)；Sigma 3K15高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma，3K15)；全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(美國Molecular，SpectraMax?i3)；水平搖床振蕩器(上海旌派，TYZD-BS)；正置顯微鏡(甘肅嘉瑞，BX40)。

1.4 方法

1.4.1貫葉金絲桃提取物的制備 將干燥的貫葉金絲桃地上部分粉碎(3 kg)，分別加10、8、8倍量70%乙醇于65 ℃回流提取3次，每次1 h，靜置，抽濾，合并3次濾液，減壓濃縮得質(zhì)量濃度為49.11 g·L-1的上樣液。然后按樣品與樹脂的質(zhì)量比為1 ∶15(g/g)上樣，上樣液緩慢、勻速地注入預(yù)先處理好的D101型大孔吸附樹脂柱(9.55 cm × 85 cm)中，以2.4 mL·min-1流速吸附26 h，分別用20%、95%乙醇以2.0 BV·h-1的流速洗脫至流出液為無色。收集95%乙醇洗脫液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液經(jīng)冷凍干燥后加入75倍量的乙酸乙酯，磁力攪拌下50 ℃加熱回流提取3次，每次1 h，靜置，抽濾，收集濾液，濃縮并冷凍干燥。將干燥后的藥粉再加入14倍量的乙酸乙酯，4 ℃靜置，濾紙過濾，濾餅干燥后得HPE，參照文獻(xiàn)[11]分析方法測(cè)得HYP含量為470.10 mg·g-1，金絲桃素含量為17.00 mg·g-1。整個(gè)提取分離過程避光操作。

1.4.2動(dòng)物分組 將80只SPF級(jí)Wistar雄性健康大鼠隨機(jī)分為常壓常氧組(normal pressure and normoxia group，NG)，低壓缺氧組(hypobaric and hypoxia group，HG)，貫葉金絲桃提取物低、中、高劑量組(HPE-L、HPE-M、HPE-H，100、200、400 mg·kg-1)，金絲桃苷低、高劑量組(HYP-L、HYP-H，50、100 mg·kg-1)和DXM(4 mg·kg-1)等8組，每組10只。灌胃用藥均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的CMC-Na助溶，NG和HG灌胃10 mL·kg-1相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CMC-Na。所用大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科飼養(yǎng)適應(yīng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。大鼠標(biāo)記用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苦味酸皮毛染色。

1.4.3大鼠高原腦水腫模型的建立 模擬高原低壓缺氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙群主要由控制系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)艙和模擬艙三部分組成。實(shí)驗(yàn)艙和模擬艙以及實(shí)驗(yàn)艙和外界環(huán)境都有獨(dú)立的艙門相隔。當(dāng)艙門打開時(shí)，兩環(huán)境下的海拔高度一致；當(dāng)實(shí)驗(yàn)艙和模擬艙艙門關(guān)閉時(shí)，可單獨(dú)模擬任一海拔高度的高原低壓缺氧環(huán)境。8組大鼠按相應(yīng)劑量連續(xù)灌胃給藥7 d。d 4時(shí)，除NG外，剩余7組均置于模擬海拔7 500 m的高原環(huán)境(艙內(nèi)壓力：35.9 kPa，氧分壓：8.0 kPa)。實(shí)驗(yàn)者每天上午8 ∶30進(jìn)入實(shí)驗(yàn)艙并以2 m·s-1勻速上升至海拔高度4 000 m，同時(shí)模擬艙以10 m·s-1勻速下降至海拔高度為4 000 m，當(dāng)兩艙體穩(wěn)定后(艙內(nèi)壓力：62.1 kPa；氧分壓：13.8 kPa)，實(shí)驗(yàn)者進(jìn)入模擬艙，進(jìn)行灌胃給藥。每次給藥后，實(shí)驗(yàn)艙以2 m·s-1勻速下降至蘭州海拔高度，模擬艙以10 m·s-1勻速升至7 500 m。期間，動(dòng)物自由進(jìn)食攝水，同時(shí)觀察大鼠生存狀態(tài)，在該環(huán)境下連續(xù)缺氧暴露72 h，并于末次給藥1 h后進(jìn)行樣本取材。

1.4.4樣本取材[5]缺氧暴露72 h結(jié)束后，斷頭處死大鼠，小心打開顱腔，摘取完整大腦組織并沿腦中線將大腦分為左腦和右腦兩部分，左腦上半部分組織用于腦含水量的測(cè)定，左腦下半部分組織-20 ℃保存并用于其他指標(biāo)的測(cè)定。右腦組織浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中，用于HE染色。NG大鼠同一時(shí)間按上述方法在常氧條件下取材。

1.4.5大鼠腦組織含水量的測(cè)定 樣本取材過程中，將分離出的左腦上半部分組織置于大小適宜的稱量紙中，即刻通過傳遞窗交至實(shí)驗(yàn)人員稱量濕重后，放入55 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，直至干重稱量誤差在0.2 mg內(nèi)上下波動(dòng)，再根據(jù)干濕比重法計(jì)算大鼠腦組織的含水量。

含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.6大鼠腦組織病理切片的制備和觀察 將完整大鼠右腦組織浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中室溫充分展開固定。組織固定好后，進(jìn)一步包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，并于正置顯微鏡下，放大200倍，觀察腦組織的病理學(xué)變化。

1.4.7大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 取-20 ℃保存的大鼠左腦下半部分組織適量，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，用研磨儀充分勻漿，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%腦組織勻漿，并于4 ℃下4 000 r·min-1離心15 min，BCA法測(cè)定腦組織勻漿液中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)各試劑盒說明書測(cè)定腦組織中MDA、GSH和H2O2的含量以及T-SOD和CAT的活力。

1.4.8大鼠腦組織炎癥因子的測(cè)定 將腦組織同1.4.7項(xiàng)下方法制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%腦組織勻漿，4 ℃ 4 000 r·min-1離心15 min。采用ELISA法，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的反應(yīng)孔吸光度(λmax=450 nm)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α的含量。

2 結(jié)果

2.1 高原缺氧大鼠生存狀態(tài)的觀察在模擬大鼠高原低壓缺氧過程中，艙內(nèi)大鼠主要表現(xiàn)為體重減輕，進(jìn)食攝水急劇減少，自主活動(dòng)以臥爬為主，行動(dòng)遲緩，呼吸困難，情緒暴躁，排便減少，糞便呈深黑色干硬狀。缺氧期間，各組動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)死亡。NG大鼠進(jìn)食攝水正常，活潑好動(dòng)，性情溫順，排便正常，糞便呈棕褐色軟糯狀，未發(fā)現(xiàn)異常及死亡情況。

2.2 HPE對(duì)HACE大鼠腦組織含水量的影響如Tab 1所示。與NG相比，HG大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.01)。與HG相比，HPE-L、HPE-M、HPE-H及DXM能明顯降低腦組織含水量(P<0.05或P<0.01)，并呈劑量依賴性；HYP-L和HYP-H雖然有降低腦組織含水量的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 1 Effects of HPE on brain water content in HACE rats

2.3 HPE對(duì)HACE大鼠腦組織病理變化的影響大鼠腦組織病理學(xué)切片如Fig 1所示。NG大鼠海馬組織細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核明顯，未出現(xiàn)胞體內(nèi)大空泡樣變。與NG相比，HG大鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核質(zhì)間隙增大(綠色箭頭)，細(xì)胞核固縮濃染(黃色箭頭)，炎性細(xì)胞浸潤(藍(lán)色箭頭)，神經(jīng)元脫失，胞體內(nèi)大空泡形成(黑色箭頭，可能為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的高度擴(kuò)張與融合)，大腦皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)組織因大量神經(jīng)元內(nèi)大空泡形成及壞死，呈海綿狀變性改變。HPE、HYP及DXM藥物干預(yù)后，腦組織病理結(jié)構(gòu)得到一定程度的改善，細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于正常，核濃染減輕(黃色箭頭)，神經(jīng)元完整清晰，細(xì)胞空泡樣變減少(黑色箭頭)，炎癥反應(yīng)緩解(藍(lán)色箭頭)。其中，HPE-M、HPE-H、HYP-H及DXM與HG相比得到了明顯改善。

2.4 HPE對(duì)HACE大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響大鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如Tab 2和Fig 2所示。與NG相比，HG大鼠腦組織勻漿液中MDA和H2O2含量明顯升高(P<0.01)，T-SOD活力、GSH含量和CAT活力明顯降低(P<0.01)。給予藥物干預(yù)后，與HG相比，HPE-M、HPE-H和HYP-L大鼠腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)；HPE-M、HPE-H、HYP-L、HYP-H和DXM大鼠腦組織中T-SOD活力和CAT活力明顯升高(P<0.01或P<0.05)。另外，與HG相比，HPE-H大鼠腦組織中H2O2含量降低、GSH含量升高(P<0.05)；其余給藥組也有降低或升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 HPE對(duì)HACE大鼠腦組織炎癥因子的影響ELISA檢測(cè)大鼠腦組織中炎癥因子的結(jié)果如Tab 3和Fig 3所示。與NG相比，HG大鼠腦組織勻漿液中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α的含量明顯升高(P<0.01)。與HG相比，HPE-H、HYP-L和HYP-H能明顯降低HACE大鼠腦組織勻漿液中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α的含量(P<0.01或P<0.05)；HPE-M能明顯降低IL-1β、IL-6和VEGF的含量(P<0.01或P<0.05)；DXM能明顯降低IL-1β、VEGF和TNF-α的含量(P<0.01或P<0.05)；HPE-L雖有降低HACE大鼠腦組織中炎癥因子含量的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 1 Histopathological changes of brain tissues in rats (×200)A:NG;B:HG;C:HPE-L;D:HPE-M;E:HPE-H;F:HYP-L;G:HYP-H;H:DXM

Tab 2 Effects of HPE on brain oxidative stress index in hypoxic rats

Fig 2 Effects of HPE on brain oxidative stress in hypoxic rats

3 討論

HACE常發(fā)生在快速上升到高海拔地區(qū)的人身上，其易感性和發(fā)展與炎癥有關(guān)。本研究在建立缺氧大鼠HACE模型的基礎(chǔ)上，通過大鼠腦組織含水量的測(cè)定、腦組織病理變化的觀察以及腦組織氧化應(yīng)激和炎癥因子相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，探討HPE對(duì)缺氧大鼠HACE的改善作用。研究結(jié)果表明，與HG相比，給予HPE與HYP藥物干預(yù)后，給藥組大鼠腦組織含水量下降，同時(shí)腦組織病理學(xué)損傷減輕，炎性因子浸潤減少，說明HPE能有效改善HACE，保護(hù)大鼠腦組織免受氧化應(yīng)激和炎癥因子的損害，維持機(jī)體健康。

Tab 3 Effects of HPE on brain tissue inflammatory factors in hypoxic rats

Fig 3 Effects of HPE on brain tissue inflammatory factors in hypoxic rats

炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF在炎癥的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。IL-1β、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，它們?cè)诿庖哌^程中介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用、急性期反應(yīng)和造血。其中，IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖和分化，在調(diào)節(jié)體內(nèi)復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)中起中心作用，可通過誘導(dǎo)和激活體內(nèi)各種免疫細(xì)胞而導(dǎo)致長期慢性炎癥[14]。IL-1β是IL-1的一種亞型，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，可致熱和介導(dǎo)炎癥[15]。VEGF是一種血小板源性生長因子，由許多細(xì)胞和組織在缺氧反應(yīng)中產(chǎn)生，它具有促進(jìn)血管通透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，細(xì)胞外基質(zhì)變性等作用。缺氧和細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等均可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)[16]。TNF-α是一種在慢性炎癥中有致病作用的脂肪細(xì)胞因子，其在體內(nèi)外均可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，當(dāng)血糖水平升高時(shí)脂肪組織就會(huì)分泌TNF-α，TNF-α的升高可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[17]。在此基礎(chǔ)上，我們檢測(cè)了7 500 m高原缺氧模擬環(huán)境下大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α的變化。結(jié)果表明，與NG相比，HG大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF的含量明顯升高，這可能是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，促使大鼠腦組織內(nèi)促炎因子的水平上升，同時(shí)，炎癥因子的增加也可能刺激自由基的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)通路。HPE與HYP藥物干預(yù)后，與HG相比，腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF含量均有不同程度的下降，說明HPE可以通過降低組織中炎癥因子的水平來發(fā)揮抗炎活性，從而緩解氧化應(yīng)激引起的炎癥損傷，調(diào)節(jié)大鼠腦組織適應(yīng)缺氧環(huán)境。因此，貫葉金絲桃有望開發(fā)成為治療HACE的藥物制劑，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。