劉文靜，楊 娟，張楚天，孫 攀，黃美雅,3，黃云梅,3

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.中西醫(yī)結(jié)合研究院;3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一種全身性骨代謝疾病，女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降，導(dǎo)致骨量減少、骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，并易發(fā)骨折。中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥具有獨(dú)特作用，如淫羊藿、補(bǔ)骨脂、杜仲、巴戟天等以其不良反應(yīng)小的臨床特點(diǎn)逐漸得到廣大患者的肯定[1]。巴戟天主產(chǎn)于我國(guó)廣東、福建、廣西等地，中藥取茜草科植物巴戟天(morindaofficinalisHow)的干燥根，可補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕[2]，具有抗炎、抗衰老、抗疲勞、促進(jìn)骨生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫等作用。巴戟天可能通過(guò)降低NFATc1的表達(dá)水平來(lái)抑制破骨細(xì)胞生成[3]，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)來(lái)抑制成骨細(xì)胞凋亡[4]等，從而改善骨質(zhì)疏松癥。

近年來(lái)，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于中藥成分及中藥作用機(jī)制的研究，通過(guò)檢測(cè)機(jī)體基礎(chǔ)代謝的變化，為闡明代謝性疾病的發(fā)病過(guò)程和病理原因提供依據(jù)[5]?；谝合嗌V與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的代謝組學(xué)分析，簡(jiǎn)便可行，使代謝物覆蓋率大大提高。本文基于LC-MS/MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法檢測(cè)巴戟天干預(yù)去卵巢后骨質(zhì)疏松大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，分析其可能受影響的代謝途徑，探討巴戟天治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥材中藥巴戟天購(gòu)于福建省醫(yī)藥公司。將3 kg生藥粗粉碎后，用20倍量蒸餾水浸沒(méi)藥材，100 ℃煎煮1 h，過(guò)濾，將藥渣用等量蒸餾水重復(fù)提取一次，取兩次的藥液混合，過(guò)濾除渣，低溫減壓濃縮成相當(dāng)于生藥量1 kg·L-1的浸膏，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑Discovery Wi雙能X線骨密度儀(美國(guó)Hologic公司)；IG-A1000N萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(日本島津儀器公司)；小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)(德國(guó)艾本德股份公司)；Q Exactive質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；UltiMateTM3000高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；HYPERSIL GOLD AQ色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)Thermo Scientific公司)；Allegra 64R冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；渦旋混合器(美國(guó)SI Votex-Genie2公司)。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣本采集 42只雌性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、巴戟天組，每組14只。模型組和巴戟天組大鼠以10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)，摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組只切除卵巢周圍少許脂肪組織，術(shù)后在大腿部以8萬(wàn)單位/只注射獸用青霉素抗感染。1周后巴戟天組大鼠按生藥5 g·kg-1·d-1體質(zhì)量灌胃給予巴戟天水提取物，模型組與假手術(shù)組分別給予生理鹽水灌胃2 mL/只。分別于第6周和第12周各取材一半，取大鼠右側(cè)股骨、脛骨及第4腰椎，并隨機(jī)每組采4只大鼠腹主動(dòng)脈血。收集的血液樣品凝固后離心(3 500 r·min-1,15 min,4 ℃)得到血清。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

1.4.2骨密度檢測(cè) 骨密度檢測(cè)于福建省中醫(yī)科學(xué)研究院，在骨密度掃描儀探頭下進(jìn)行檢測(cè)，并由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析得出大鼠右側(cè)股骨骨密度(bone mineral density,BMD)相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4.3骨骼生物力學(xué)性能檢測(cè) 骨骼生物力學(xué)性能檢測(cè)于福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，使用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)分別運(yùn)用三點(diǎn)抗彎法和壓縮法測(cè)定大鼠右側(cè)脛骨以及第4椎的最大載荷。

1.4.4血清樣本檢測(cè) 大鼠血清代謝組學(xué)檢測(cè)由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。具體實(shí)驗(yàn)方法和條件如下：

1.4.4.1 樣品處理 將樣品冰上解凍，取350 μl樣品，離心(1 400g,10 min,4 ℃)去除血細(xì)胞。取300 μL樣品，加入900 μL預(yù)冷甲醇溶液。震蕩混勻2～3 min，使其萃取充分，離心(14 000g,10 min,4 ℃)。取240 μL上清液，共4份，真空干燥后，每份加60 μL 50%(V/V)甲醇-水配制樣品復(fù)溶液復(fù)溶，離心(14 000g,5 min,4 ℃)，取40 μL上清轉(zhuǎn)入新的上樣瓶，加等體積50%(v/v)甲醇-水混合，離心(14 000g,5 min,4 ℃)，取上清液用于超高效液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)檢測(cè)。

1.4.4.2 色譜條件 正離子模式：流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；負(fù)離子模式：流動(dòng)相為5 mmol·L-1醋酸銨水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脫：0～1 min，100% A，0%B；9～12 min，0% A，0% B；12.1～15 min，100% A，0% B；流速0.35 mL·min-1。

綜上所述，在部編版小學(xué)低年級(jí)語(yǔ)文教材中，識(shí)字寫字板塊強(qiáng)調(diào)要讓學(xué)生堅(jiān)持多認(rèn)少寫的原則來(lái)進(jìn)行識(shí)字寫字的學(xué)習(xí)。為了提高學(xué)生的識(shí)字寫字學(xué)習(xí)效率，教師要積極尋找靈活有效的識(shí)字寫字方法，提高學(xué)生的識(shí)字寫字效率。

1.4.4.3 質(zhì)譜條件 1 μL質(zhì)量控制(quanlity contral，QC)樣品上清液，先進(jìn)正離子掃描，所有樣品結(jié)束后再進(jìn)行負(fù)離子掃描，全掃描范圍m/z 70～1 050。母離子的離子強(qiáng)度TOP15，使用HCD方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜序列鑒定，獲得質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)。

1.4.5數(shù)據(jù)處理 對(duì)血清樣品進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-MS/MS)。所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover (CD)軟件，對(duì)原始采集數(shù)據(jù)進(jìn)行校正包括噪音過(guò)濾、保留時(shí)間對(duì)齊、質(zhì)譜峰提取、樣品間化合物對(duì)應(yīng)、化合物鑒定、Gap的填補(bǔ)、背景值的扣除及數(shù)據(jù)歸一化與標(biāo)準(zhǔn)化處理等。其中，化合物鑒定由mzCloud和綜合數(shù)據(jù)庫(kù)ChemSpider在線搜索完成，設(shè)定mass tolerance在5 ppm范圍內(nèi)即表示理論分子量與實(shí)測(cè)分子量匹配，通過(guò)系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)與實(shí)測(cè)分子量匹配的代謝物的信息?；赒C樣品TIC圖疊加，查看UHPLC-MS檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；采用OPLS-DA建模方法利用正交信號(hào)矯正的思想，把與響應(yīng)變量無(wú)關(guān)的正交變量分離出去。通過(guò)層次聚類分析觀察組間變化情況及火山圖展示代謝物變化情況。運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)單因素方差分析，通過(guò)京都基因與基因百科全書KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomoes)Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異代謝物的代謝通路注釋和富集分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨密度檢測(cè)結(jié)果大鼠股骨近端BMD檢測(cè)結(jié)果顯示(Tab 1)：模型組BMD值都明顯低于同期假手術(shù)組(6周P<0.05，12周P<0.01)，巴戟天組較同期模型組其BMD有所提升。

Tab 1 Bone mineral density of proximal

2.2 大鼠骨生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果脛骨與腰椎生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示(Tab 2)：模型組骨組織生物力學(xué)最大載荷均明顯低于同期假手術(shù)組(6周脛骨最大載荷P<0.05，腰椎最大載荷P<0.005；12周均為P<0.005)；巴戟天組較模型組有一定程度提升(6周腰椎最大載荷P<0.005)。

Tab 2 Maximum load test results of tibia and fourth lumbar vertebra of rats in each group(KN,

Tab 3 Main parameters of OPLS-DA model

Fig 1 Tic diagram of rat serumA：Positive ion mode;B：Negative ion mode

2.3 基于LC-MS/MS平臺(tái)的大鼠血清代謝組學(xué)檢測(cè)QC樣品基于UHPLC-MS/MS平臺(tái)結(jié)合正離子模式和負(fù)離子模式兩種電離模式，通過(guò)TIC圖疊加，查看LC-MS檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。大鼠血清樣品總離子色譜圖見Fig 1。

2.4 血清代謝物譜的組間差異使用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)研究假手術(shù)組、模型組及巴戟天組大鼠的代謝物譜差異。假手術(shù)組和模型組的組內(nèi)血清樣本點(diǎn)在一定范圍較好的聚集，且組間差異明顯，說(shuō)明去卵巢后骨質(zhì)疏松大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變；模型組和巴戟天組組間樣本完全區(qū)分開，說(shuō)明藥物干預(yù)后大鼠機(jī)體代謝發(fā)生變化(Fig 2)。OPLS-DA 模型的主要參數(shù)(Tab 3)驗(yàn)證了本文建立的OPLS-DA模型的可靠性較高。

2.5 層次聚類分析結(jié)果分層聚類分析所得熱圖直觀顯示出正負(fù)離子通道鑒定的所有血清代謝物在各組之間的含量變化趨勢(shì),干預(yù)6周與干預(yù)12周趨勢(shì)整體一致，12周時(shí)尤為明顯，如Fig 3所示。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣品與變量信息。模型組與假手術(shù)組顯著分開提示去卵巢大鼠機(jī)體代謝發(fā)生變化；巴戟天組與模型組明顯分開且接近假手術(shù)組，提示中藥可調(diào)節(jié)去卵巢大鼠機(jī)體的代謝。

Fig 2 OPLS-DA score plots derived from LC-MS/MS spectra of serum

2.6 表征代謝物譜差異的生物標(biāo)志物火山圖(Fig 4)中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)代謝物，使用OPLS-DA模型中變量重要性投影(VIP)參數(shù)評(píng)價(jià)潛在的生物標(biāo)志物。經(jīng)t檢驗(yàn)(Pvalue <0.05，VIP>1)最終篩選出29種具有顯著差異的化合物(Tab 4、5)。組間對(duì)比結(jié)果顯示：模型組脂類及核酸代謝相關(guān)的化合物乙酰左旋肉堿、花生四烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、尿嘧啶、胞嘧啶核苷及2’-脫氧尿苷等含量較假手術(shù)組均下降。同期巴戟天組較模型組脂類及核酸代謝相關(guān)的化合物乙酰左旋肉堿、花生四烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、尿嘧啶、胞嘧啶核苷及2′-脫氧尿苷等含量均上升。經(jīng)單因素方差分析顯示(Fig 5)，泛酸、皮質(zhì)酮、硬脂酸、尿嘧啶、胞嘧啶核苷、2′-脫氧尿苷等組間差異有顯著性(P<0.05)。

2.7 差異代謝物的相關(guān)代謝通路富集分析結(jié)合2.6中所篩選的差異代謝物，通過(guò)其相關(guān)代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸的生物合成、類固醇激素生物合成及初級(jí)膽汁酸代謝等通路影響值>0.10。表明OPLS-DA所篩選的差異代謝物與這些代謝途徑密切相關(guān)，推測(cè)去卵巢后大鼠體內(nèi)代謝變化及巴戟天發(fā)揮治療作用與這些代謝途徑有關(guān)。

Tab 4 Chemical information of related markers in postmenopausal osteoporosis model after normalization

Fig 4 Volcano picture of DEM about potentially different metabolites

Fig 5 Metabolites with significant difference (n=4)

Tab 6 Result from pathway analysis (Impact>0.10)

3 討論

本研究采用去卵巢術(shù)建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，通過(guò)骨密度與骨生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果可知，巴戟天干預(yù)可改善去卵巢后骨質(zhì)疏松癥骨量減少和骨強(qiáng)度下降，與既往研究結(jié)果一致[6]。

有臨床研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中油酸、亞油酸及花生四烯酸等 5 種脂肪酸水平高于正常婦女[7]。何若晗等[8]的代謝組學(xué)研究表明，去卵巢大鼠機(jī)體代謝紊亂，內(nèi)源性代謝物含量變化異常，尤其是甘油三酯、鞘磷脂和 ω-6 不飽和脂肪酸等脂代謝相關(guān)產(chǎn)物。盛玲玲等[9]基于尿液代謝的組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠初級(jí)膽汁酸生物合成和嘌呤代謝紊亂。由此可見代謝異常與 PMOP 密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠體內(nèi)脂代謝相關(guān)因子的變化最明顯。不飽和脂肪酸如硬脂酸、二十碳五烯酸、花生四稀酸、油酸和亞油酸,及乙酰左旋肉堿等在模型組中的含量較假手術(shù)組降低。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)在線檢索發(fā)現(xiàn)這些代謝物與不飽和脂肪酸生物合成及花生四烯酸代謝等代謝通路有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，乙酰左旋肉堿具有抗氧化、抗炎癥及促進(jìn)脂肪代謝等作用[10]。本研究結(jié)果是對(duì)PMOP與脂代謝相關(guān)理論的補(bǔ)充。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，脂代謝紊亂可導(dǎo)致骨代謝異常。脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞均由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，二者此消彼長(zhǎng)。脂代謝紊亂使成骨細(xì)胞分化減少，從而引起骨代謝相關(guān)疾病[11]。脂代謝可通過(guò)多種通路影響骨代謝。脂代謝與骨代謝的共同信號(hào)通路中，氧化應(yīng)激信號(hào)通路中氧化脂質(zhì)可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞生成導(dǎo)致骨吸收，惡化骨破壞，并且誘發(fā)炎癥反應(yīng)[12]。多不飽和脂肪酸可通過(guò)減少炎癥類花生酸，發(fā)揮抗炎作用，改善骨骼肌質(zhì)量[13-14]，補(bǔ)充ω-3多不飽和脂肪酸(主要包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)可降低骨量丟失，提高骨強(qiáng)度[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天組較模型組含量升高，說(shuō)明巴戟天可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝途徑改善去卵巢骨質(zhì)疏松。

此外，本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，模型組中與核酸代謝相關(guān)的尿嘧啶、胞嘧啶核苷、2’-脫氧尿苷等化合物含量較假手術(shù)組降低，而巴戟天組含量較模型組均升高。皮質(zhì)酮、泛酸及膽汁酸等差異代謝物含量也發(fā)生了變化。皮質(zhì)酮作為類固醇激素之一，與花生四烯酸相互作用，干擾正常生理行為并引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低雌激素的護(hù)骨作用[16]。泛酸與生物體內(nèi)能量調(diào)節(jié)及糖類、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝相關(guān)，是合成類固醇所必需的物質(zhì)。膽汁酸可調(diào)節(jié)脂代謝、糖代謝、炎癥反應(yīng)[17]，也可影響維生素D吸收，對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生不利影響[18]。

綜上所述，基于LC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢后大鼠體內(nèi)脂代謝、嘧啶代謝及能量代謝等代謝紊亂，巴戟天干預(yù)可改善其代謝情況。因此，巴戟天可能通過(guò)調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸的生物合成、類固醇激素生物合成、膽汁酸代謝及嘧啶代謝等多種代謝通路改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。本研究可為巴戟天后續(xù)研究與開發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。