房 媛，李 倩，羅貫豪，彭德威，李路安，李巧巧，羅雪珊，鄧春玉，薛玉梅，饒 芳，吳書林

(華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床上常見的心律失常之一，可導(dǎo)致血栓栓塞和心力衰竭等并發(fā)癥，嚴重影響患者生活質(zhì)量，已成為公共健康問題[1]。心房電重構(gòu)是指心房肌細胞的電生理特性發(fā)生改變，是AF發(fā)生的主要病理機制之一[2]，其主要內(nèi)容包括心房有效不應(yīng)期(atrial effective refractive period，AERP)和動作電位時程(action potential duration，APD)的縮短，頻率適應(yīng)性下降等。已有研究表明[3]，ICa,L以及L型鈣通道蛋白α1c亞單位(L-type calcium channel α1C，Cav1.2)表達在AF患者及AF動物模型中下降，與APD和AERP縮短密切相關(guān)。

流行病學(xué)研究顯示[4]，高血壓是AF發(fā)生的重要心血管風(fēng)險因素之一。然而，機械應(yīng)力在AF發(fā)病中的作用尚未闡明。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，高靜水壓可通過誘導(dǎo)HL-1細胞ICa,L和Cav1.2表達下調(diào)導(dǎo)致心房肌細胞發(fā)生電重構(gòu)，使AF易于發(fā)生[5]。但目前關(guān)于高靜水壓導(dǎo)致AF電重構(gòu)的具體分子機制研究甚少。Piezo1是近年鑒定出的哺乳動物中的機械門控離子通道，可將機械力轉(zhuǎn)變?yōu)樯镄盘枀⑴c細胞的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。在感知和調(diào)節(jié)血管機械壓力方面起重要作用。血管內(nèi)皮細胞上的Piezo1可介導(dǎo)流體剪切力引起的動脈擴張，以維持成年小鼠的基礎(chǔ)血壓[7]。拉伸力可激活小動脈平滑肌細胞的Piezo1，上調(diào)細胞中Ca2+濃度，影響高血壓時小動脈血管結(jié)構(gòu)重塑[8]。但Piezo1在心房肌細胞中的表達和功能研究有限。

c-Src編碼膜相關(guān)的酪氨酸激酶，參與細胞生長和分化，亦可通過調(diào)控心房肌細胞ICa,L的通道功能參與AF的發(fā)生[9]。我們的前期研究提示Src參與了高靜水壓下心房肌細胞的ICa,L以及Cav1.2蛋白的表達下降。然而，壓力激活Src的上游分子機制仍需進一步探究。本研究旨在探討機械敏感性離子通道Piezo1在調(diào)控高靜水壓下心房肌細胞電重構(gòu)中的作用并探索其可能的分子機制，為臨床上高血壓合并AF的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及取材30～32周齡♂ SPF級SHR 16只，與之周齡、性別匹配的Wistar大鼠8只作為對照，購自北京維通利華，生產(chǎn)許可號為SCXK(京)2016-0006，質(zhì)量檢測單位為中山大學(xué)實驗動物中心。經(jīng)中山大學(xué)實驗動物倫理委員會審核(SYSU-IACUC-2020-000220)。將SHR隨機分為2組，SHR組和SHR+Val組(30 mg·kg-1·d-1)，以及對照組Wistar大鼠，連續(xù)灌胃給藥8周，每日1次。完成相關(guān)實驗操作后進行取材，留取心房組織，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑和儀器抗Cav1.2抗體(Alomone，ACC003AN4902)；抗Piezo1抗體(Alomone，APC-087)；抗Src抗體(AbcamAB47405)；抗GAPDH抗體(Proteintech，075501)；RIPA裂解液(Beyotime Biotechnology，3228972)，一抗、二抗稀釋液(Absin，D29A01)，兔二抗/鼠二抗(CST，7074/7076)；凝膠電泳裝置(Bio-Rad)；超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(GE ImageQuant LAS500)，P97拉制儀(Sutter，America)，EPC10膜片鉗放大器及附件(HEKA，德國)。

1.3 方法

1.3.1心房肌細胞株HL-1細胞的培養(yǎng) HL-1細胞由William Claycomb教授(美國路易斯安那州立大學(xué))惠贈。纖維連接蛋白和0.2 g·L-1凝膠預(yù)處理培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μmol·L-1去甲腎上腺素、2 mmol·L-1谷氨酰胺的Claycomb培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。定期顯微鏡下觀察細胞密度及狀態(tài)。每24～48 h換液1次。細胞密度長至60%-70%對細胞進行相應(yīng)處理。使用本課題組自行研制的加壓裝置(專利號：20140109263.1，中國)對HL-1細胞進行高靜水壓造模，分別予以0、20、40 mmHg處理。

1.3.2Western blot實驗 取黃豆大小動物左心耳組織標本，眼科剪剪碎和實驗處理后的HL-1細胞，預(yù)冷PBS沖洗，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min。12 000 r·min-1離心15 min，留取上清。BCA法測定蛋白濃度，20～40 μg樣本用中性裂解液及4×上樣緩沖液配置成等上樣體積，55 ℃或100 ℃加熱10 min變性蛋白。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，恒壓80 mV 電泳30 min 后轉(zhuǎn)120 mV電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂牛奶TBST室溫封閉1 h，一抗(目的蛋白1 ∶1 000,GAPDH 1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜。次日用抗兔或抗鼠Ⅱ抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h后TBST洗膜。ECL試劑盒顯影蛋白條帶，使用軟件ImageJ測量目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.3.3全細胞膜片鉗記錄 細胞消化貼壁1～2 h后進行膜片鉗實驗。采用兩步法拉制玻璃電極，灌注電極內(nèi)液指彈法排出氣泡并將電極置于推進器上，控制電極尖端入液后的電阻在2～5 MΩ間，出現(xiàn)方波后補償液接電位。細胞產(chǎn)生微小形變，方波跳動電阻微升時進行細胞封接，待高阻(阻抗>1 GΩ)封接穩(wěn)定后，負壓或電破膜形成穩(wěn)定的全細胞狀態(tài)，快慢電容及串聯(lián)電阻補償后，形成全細胞記錄。通過EPC10膜片鉗放大器記錄信號。在電壓鉗模式下將細胞鉗制在-40 mV，施以自-50～+50 mV，階躍10 mV，波寬300 ms，頻率0.2 Hz的刺激，測量并記錄膜電容(membrane capacitance，Cm)及ICa,L，電流鉗模式下測量并記錄AP。使用Patchmaster軟件控制命令電位并進行數(shù)據(jù)采集。使用Clampfit 10.4軟件對單個記錄進行數(shù)據(jù)測量。ICa,L細胞外液成分(mmol·L-1)：TEA-Cl 140，CaCl2·2H2O 5，MgCl2·6H2O 2，Glucose·H2O 10，HEPES 10，用Tris將pH調(diào)至7.4。ICa,L細胞內(nèi)液成分(mmol·L-1):Choline-Cl 126，CsCl 5.4，MgCl2·6H2O 1，NaH2PO4·2H2O 0.33，Glucose·H2O 10，HEPES 10，CaCl2·2H2O 2，用CsOH將pH調(diào)至7.4。記錄AP的細胞外液成分(mmol·L-1):NaCl 136，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 1，D-glucose 10，HEPES 10，CaCl2·2H2O 1.8，NaH2PO4·2H2O 0.33，用NaOH將 pH 調(diào)至7.4。記錄AP的電極內(nèi)液成分(mmol·L-1):KCl 140，MgCl2·6H2O 1，HEPES 10，EGTA 5，Na2-ATP 5，用KOH 使pH調(diào)至7.2。

2 結(jié)果

2.1 大鼠左心耳組織蛋白表達結(jié)果Western blot結(jié)果顯示與對照組Wistar大鼠相比，SHR左心耳組織中的Cav1.2表達下降(P<0.01)，而Piezo1(P<0.01)和Src的表達升高(P<0.05)；纈沙坦干預(yù)后，可使SHR心房Cav1.2蛋白表達回升(P<0.05)，Piezo1(P<0.01)和Src(P<0.05)蛋白表達下調(diào)(Fig 1)。提示高血壓可誘導(dǎo)心房肌細胞電重構(gòu)，Piezo1/Src信號通路可能參與相關(guān)病理過程。

2.2 高靜水壓對心房肌細胞電重構(gòu)的影響通過自制的高壓裝置，為體外培養(yǎng)的心房肌HL-1細胞施予一定的高靜水壓(20或40 mmHg)負荷。全細胞膜片鉗檢測心房肌細胞APD和ICa,L，結(jié)果顯示，相較于常壓組，20 mmHg組的APD無明顯改變(P>0.05，n=9/10)，而40 mmHg組APD90(74.23±19.83 ms in 0 mmHgvs63.81±20.22 ms in 20 mmHg,及50.03±6.62 ms in 40 mmHg)、APD70(50.38±15.01 ms in 0 mmHgvs39.13±13.21 ms in 20 mmHg及29.42±4.60 ms in 40 mmHg)，APD50(27.87±9.27 ms in 0 mmHgvs22.39±9.49 ms in 20 mmHg及16.97±4.04 ms in 40 mmHg)均明顯縮短(APD50,APD90,P<0.05，APD70P<0.01，n=7 in 40 mmHg)(Fig 2A-B)。但3組間的動作電位幅值(action potential amplitude,APA)無明顯改變(Fig 2C)。ICa,L的峰值電流密度呈壓力依賴性的減少(峰值電壓+10 mV時，-2.48±0.13 pA/pF in 0 mmHgvs-1.56±0.15 pA/pF in 20 mmHgvs-0.75±0.07 pA/pF in 40 mmHg，P<0.01，n=10/8/11 in 0 mmHg,20 mmHg及40 mmHg group)(Fig 2D-E)。

隨壓力梯度增加，Cav1.2蛋白表達降低(P<0.05 in 40 mmHg)，而Piezo1和Src的蛋白表達明顯增加(P<0.05,P<0.01 in 40 mmHg)(Fig 2F-G)。與動物模型的結(jié)果一致，表明高靜水壓可促進心房肌細胞電重構(gòu)，表現(xiàn)為ICa,L減少且Cav1.2表達降低，APD縮短，Piezo1/Src信號通路可能在其中發(fā)揮作用。

2.3 Piezo1抑制劑GsmTx4可逆轉(zhuǎn)高壓條件下HL-1細胞的電重塑高壓(40 mmHg)處理HL-1細胞前予Piezo1抑制劑GsmTx4(3.0 μmol·L-1)預(yù)處理1 h，記錄心房肌細胞AP和ICa,L。結(jié)果表明，相較于40 mmHg加壓組，APD90(50.03±6.62 ms in 40 mmHgvs72.25±21.94 ms in 40 mmHg+GsmTx4)、APD70(29.42±4.60 ms in 40 mmHgvs45.27±12.35 ms in 40 mmHg+GsmTx4)、APD50(16.97±4.04 ms in 40 mmHgvs27.87±9.32 ms in 40 mmHg+GsmTx4)均明顯延長(P<0.05，n=9/7/11 in 0 mmHg,40 mmHg及40 mmHg+GsmTx4)，APA無明顯變化(Fig 3)。ICa,L的激活電位，鋒電位以及反轉(zhuǎn)電位無明顯影響(Fig 4A-B)，但ICa,L峰值電流密度明顯增加(峰值電壓+10 mV時，-2.48±0.13 pA/pF in 0 mmHgvs-0.75±0.07 pA/pF in 40 mmHgvs-1.88±0.15 pA/pF in 40 mmHg+GsmTx4，P<0.01,n=10/11/11 in 0 mmHg,40 mmHg及40 mmHg+GsmTx4)(Fig 4C)，ICa,L的激活曲線和復(fù)活曲線在加壓后負向移動，失活曲線在加壓后正向移動，并均在加入抑制劑后逆轉(zhuǎn)。但動力學(xué)上差異均無顯著性(P>0.05)(Fig 4D-E)。

與電流結(jié)果一致，Cav1.2的表達在加入GsmTx4后回升(P<0.05)(Fig 4F)，同時，Src表達明顯下降(P<0.05)(Fig 4G-H)。提示Piezo1通過Src參與高壓下ICa,L的下調(diào)。

2.4 Piezo1激動劑Yoda1模擬高壓條件下Cav1.2表達的下調(diào)常壓下給予不同濃度(1，3，10 μmol·L-1)的Piezo1特異性激動劑Yoda1處理HL-1細胞48 h，結(jié)果顯示，與對照組(DMSO組)相比，Yoda1(10 μmol·L-1)可使Cav1.2的表達下調(diào)(P<0.01)，而Src的表達上調(diào)(P<0.01)(Fig 5)。與上述高靜水壓處理結(jié)果一致。

3 討論

本研究旨在探討高靜水壓對心房肌細胞電重構(gòu)的影響及可能的機制。我們發(fā)現(xiàn)，1)與Wistar大鼠相比，Piezo1和Src蛋白表達升高，而Cav1.2的蛋白表達下降。給予降壓藥物纈沙坦后上述指標均出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。2)給予心房肌細胞HL-1細胞高靜水壓干預(yù)后，可使細胞的ICa,L和Cav1.2蛋白表達下調(diào)，APD縮短，Src激活；而抑制Piezo1可使心房肌細胞電重構(gòu)得到改善；常壓下激動Piezo1，心房肌細胞可發(fā)生類似于高壓狀態(tài)下心房肌細胞的電重構(gòu)及相關(guān)信號分子的改變。表明高壓狀態(tài)下，新型機械力敏感性離子通道Piezo1可激活Src，引起ICa,L以及Cav1.2表達下降進而引心房電重構(gòu)。

盡管高血壓和AF之間的流行病學(xué)聯(lián)系已經(jīng)確立，但高血壓患者AF易感性增加的發(fā)病機制仍不完全清楚[10]。體內(nèi)心血管系統(tǒng)主要承受3種力學(xué)刺激，血流對細胞表面產(chǎn)生的摩擦力-剪切應(yīng)力，搏動的血流使血管擴張和回縮產(chǎn)生的牽張力，以及血流對單位面積血管壁的側(cè)壓力(即血壓)，也稱為靜水壓[11]。高血壓患者左室舒張功能受損，左心房壓力升高，其主要的機械應(yīng)力變化為靜水壓和牽張力的增加。單個心房肌細胞受到的拉伸和壓力增加，是心房重構(gòu)過程的主要刺激因素[10]。在多種高血壓動物模型中，證實高血壓可引起心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu)，從而增加房性心律失常的易感性[12-13]。但機械力學(xué)在其中所起的直接作用及其相關(guān)分子機制遠未闡明。目前，已有的機械力學(xué)在AF發(fā)病細胞機制方面的研究多關(guān)注牽張力，卻忽略了壓力和容量負荷所致的高壓負荷這一重要致病因素。高靜水壓導(dǎo)致心房肌細胞電重構(gòu)，進而導(dǎo)致AF的研究較少。

AF的電重構(gòu)是指心房肌電生理特性發(fā)生改變。1995年，心房電重構(gòu)的概念首次被Wijffels等[14]提出，即“房顫致房顫”假說。房顫維持的心房重構(gòu)因素包括APD和AERP縮短，心房不應(yīng)期頻率適應(yīng)不良等。L型鈣通道以及ICa,L下降與APD的縮短密切相關(guān)[15]。我們的前期研究顯示，炎癥和高靜水壓可通過誘導(dǎo)ICa,L和Cav1.2表達下降導(dǎo)致心房肌細胞電重構(gòu)，使AF易于發(fā)生[16]。但細胞如何感知靜水壓力的升高并發(fā)生下游一系列重構(gòu)效應(yīng)目前尚未完全闡明。

Fig 2 Effect of high hydrostatic pressure on ion channel remodeling and expression of Piezo1 and Src in HL-1

Fig 3 Effects of GsmTx4 on APD in HL-1 cells after high hydrostatic pressure

Fig 4 Effect of GsmTx4 on electrophysiological properties of ICa,L and protein expression of Cav1.2 in HL-1 cells after high hydrostatic pressure

Fig 5 Effect of Yoda1 on protein expression of ion channel Cav1.2 and Src in HL-1

機械敏感性離子通道是一種能夠感受細胞膜機械力變化，將機械信號轉(zhuǎn)化為電信號或化學(xué)信號的離子通道。新型離子通道Piezo是新近鑒定出來的哺乳動物機械門控離子通道，包含Piezo1和Piezo2兩個結(jié)構(gòu)類似的蛋白。不同于Piezo2在感覺組織中表達，Piezo1主要在暴露于流體壓力的非感覺組織中表達，廣泛參與血管發(fā)育、動脈重塑和血壓調(diào)節(jié)等病理生理過程中[7-8]。但其在心房肌細胞中的表達和功能研究有限，現(xiàn)有研究也僅關(guān)注了牽張力[17]。因此，本研究以高血壓大鼠和HL-1細胞為研究對象，探究Piezo1是否在機械應(yīng)力增加(高靜水壓)所致心房肌細胞電重塑中起作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1在高壓情況下表達上調(diào)，且激動Piezo1可模擬高壓情況下的電重塑改變，而加入Piezo1抑制劑后鈣電流以及蛋白表達的改變發(fā)生逆轉(zhuǎn)，雖然電流的峰值大小在加壓以及加入抑制劑后發(fā)生相應(yīng)的變化，但是通道動力學(xué)表現(xiàn)上各組間均無明顯差異，提示ICa,L下降是通道蛋白表達量的下降所致。上述結(jié)果表明Piezo1通過下調(diào)L型鈣通道蛋白的表達參與了高壓下心房肌細胞的ICa,L下降，進而引起心房肌細胞電重塑。

Src激酶家族是一些具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)，在細胞增殖和分化等功能中發(fā)揮重要作用。雖然其在致癌中的作用已得到廣泛的研究，但在心律失常中的重要作用研究甚少[18]。我們的前期研究提示，高靜水壓下Src參與L型鈣通道的表達下降以及ICa,L的下降，引發(fā)電重構(gòu)最終導(dǎo)致AF的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激動Piezo1可激活Src，而抑制Piezo1則逆轉(zhuǎn)其激活，證明了Src可作為Piezo1的下游，參與心房肌細胞的電重構(gòu)。但是，Piezo1對其具體的激活機制尚需進一步的探究。

綜上所述，本研究證實了Piezo1通過激活Src參與高壓下心房肌細胞ICa,L的下降，引起心房肌細胞電重構(gòu)進而促進AF的發(fā)生。

(致謝:本實驗研究在廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部心血管藥理實驗室進行，在此非常感謝各位實驗室成員對本實驗研究所付出的艱辛努力。)