崔玉娟,胡丹東,楊穎麗,張 繼

(1.北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 102100；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.北京市延慶區(qū)市場(chǎng)監(jiān)管檢驗(yàn)檢測(cè)監(jiān)控中心，北京 102100)

單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是皰疹病毒中最典型的代表，具有高度的傳染性。HSV通常通過(guò)黏膜、皮膚、神經(jīng)組織和其他相關(guān)病變感染身體，它可分為HSV-1和HSV-2兩種血清型，其中HSV-1的占比超過(guò)了約80%。感染HSV-1主要會(huì)導(dǎo)致咽炎、唇皰疹和角膜炎，嚴(yán)重者會(huì)引起散發(fā)性腦炎等危險(xiǎn)疾病，HSV-2主要通過(guò)受損的皮膚黏膜侵入引起生殖器皰疹[1]。HSV-1感染宿主細(xì)胞后，即刻早期基因(α基因)、早期基因(β基因)和晚期基因(γ基因)開(kāi)始表達(dá)[2]。感染細(xì)胞蛋白(ICP4)表達(dá)在感染后2～4 h達(dá)到峰值，激活β基因的表達(dá)；ICP8和ICP27調(diào)控病毒DNA復(fù)制并參與γ基因轉(zhuǎn)錄；糖蛋白D(gD)是γ基因編碼的晚期蛋白，在感染后12～15 h達(dá)到峰值，是病毒包膜的主要成分，有助于病毒吸收進(jìn)入宿主細(xì)胞，所有這些指標(biāo)均可用于評(píng)估HSV-1的活性[3-4]。

黃連素(berberine，BE)是一種原小檗堿類(lèi)生物堿，存在于小檗科、毛茛科等多種植物科中[5]。BE具有多種藥用功效，包括抗炎、抗菌和抗真菌活性，同時(shí)作用于一系列信號(hào)通路以改善多種疾病[6-7]。多項(xiàng)體外研究發(fā)現(xiàn)，BE可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-10]，通過(guò)增加一些相關(guān)信號(hào)(如 JNK/p38信號(hào)分子)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，積累的信號(hào)分子可以激活JNK/p38通路，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-XL，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放和半胱天冬酶的激活[11]。近年來(lái)，BE被發(fā)現(xiàn)對(duì)多種病毒具有抗病毒作用，包括甲型流感病毒[12]、呼吸道合胞病毒[13]、基孔肯雅病毒[14]、腸道病毒71[15]等常見(jiàn)病毒。然而，其在HSV-1中的作用和抗病毒分子機(jī)制感染情況還需要進(jìn)一步研究探討。

本研究旨在探索BE對(duì)HSV-1感染的HEp-2細(xì)胞的抗病毒作用機(jī)制。分子機(jī)制通過(guò)對(duì)gD、ICP4、ICP5、ICP8、LncRNA NRAV、miR-299-3p、RAB5C、PI3K、AKT、JNK、p38轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的變化進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明BE能劑量依賴(lài)性地提升HSV-1感染后HEp-2細(xì)胞的活性，并抑制其凋亡；還可以劑量依賴(lài)性地抑制HEp-2細(xì)胞中PI3K、AKT、JNK和p38蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HSV-1：美國(guó)菌種保存中心；HEp-2懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：上海泊杰醫(yī)療科技有限公司；BE(純度≥98%)：南京朗澤生物科技有限公司、RPMI 1640培養(yǎng)基、Cell Counting Kit-8、TBST、5%脫脂牛奶、硝酸纖維素膜：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司、HSV-1病毒核酸抽提試劑盒：上海烜雅生物科技有限公司；BCA試劑盒：南京艾思易生物科技有限公司；SYBR green PCR預(yù)混液、RIPA裂解液、擴(kuò)增試劑盒、TRIzol、Lipofectamine 2000：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；單克隆抗體：美國(guó)Cell Signaling Technology；lncRNA NRAV、miR-299-3p、RAB5C、lncRNA NRAV short-hairpin RNA、miR-299-3p、RAB5C short-hairpin RNA、NC-lncRNA NRAV、NC-miR-299-3p、NC-RAB5C：湖南普拉特澤生物科技有限公司。

1.2 儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；TaqMan探針：德國(guó)Applied Biosystems；PCR系統(tǒng)StepOnePlus：德國(guó)Applied Biosystems；酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；流式細(xì)胞分析儀：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞系培養(yǎng)和分組 HEp-2使用含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEp-2按照1×105/孔接種于6孔板中。隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)：細(xì)胞未經(jīng)處理；感染組(HSV-1組)：細(xì)胞感染相應(yīng)量的HSV-1；低濃度組(5 μmol·L-1-BE組)：細(xì)胞感染相應(yīng)量的HSV-1和5 μmol·L-1的BE溶液20 μL；中濃度組(10 μmol·L-1-BE組)細(xì)胞感染相應(yīng)量的HSV-1和10 μmol·L-1的BE溶液20 μL；高濃度組(15 μmol·L-1-BE組)：細(xì)胞感染相應(yīng)量的HSV-1和15 μmol·L-1的BE溶液20 μL。隨后繼續(xù)在在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在60 mm培養(yǎng)皿中以3.0×105個(gè)/皿的密度培養(yǎng)24 h。然后，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將相關(guān)質(zhì)?；蛘咝蛄? μg轉(zhuǎn)染至HEp-2中，培養(yǎng)48 h。隨后按照上述操作進(jìn)行BE干預(yù)與HSV-1感染。

1.3.3信號(hào)通路干預(yù)處理 使用PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002與JNK/p38 MAPK信號(hào)通路激動(dòng)劑Anisomycin對(duì)HEp-2預(yù)處理24 h，隨后按照上述操作進(jìn)行BE干預(yù)與HSV-1感染。

1.3.4細(xì)胞活性檢測(cè) 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲細(xì)胞并用于制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，調(diào)整細(xì)胞密度并將細(xì)胞以4×103/孔的密度轉(zhuǎn)移到96孔板中。細(xì)胞在正常條件下(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)，在24 h時(shí)按適當(dāng)順序加入10 μL CCK-8溶液，孵育48 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量光密度值(450 nm)。

1.3.5qRT-PCR檢測(cè) 取各組細(xì)胞，加入TRIzol 400～600 μL，充分?jǐn)嚢柚翝{液狀，并移至EP管中，加入剩余TRIzol，終體積1 mL。冰上孵育5 min，離心(12 000 r·min-1，4 ℃)5 min取得上清液，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，用2-ΔΔCT法計(jì)算各組細(xì)胞中的gD、ICP-4、ICP-8、ICP-27、LncRNA NRAV、miR-299-3p、RAB5C的mRNA相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系：4×One step miRNA RT Solution，10×正、反引物序列，RNase Free H2O。反應(yīng)步驟：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。特異性引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 The specific primer sequence

1.3.6Western blot分析 在含有蛋白酶抑制劑的 RIPA緩沖液中收獲HEp-2細(xì)胞。裂解液離心(12 000 r·min-1，4 ℃)15 min后除去不溶性細(xì)胞部分，并使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)12%SDS-PAGE電泳從每個(gè)樣品中分離出等量的蛋白質(zhì)(20 μg)并轉(zhuǎn)移到NC膜。將NC膜與在含有0.05% Tween-20的TBST緩沖鹽溶液和含5%脫脂牛奶在室溫孵育2 h封閉。然后將NC膜與一級(jí)和二級(jí)HRP偶聯(lián)抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光使膜可視化，并測(cè)量和量化條帶強(qiáng)度。

1.3.7細(xì)胞凋亡能力檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于DMEM+10%胎牛血清(FBS)中培養(yǎng)，將細(xì)胞以5×105/孔的密度接種到6孔板上并生長(zhǎng)24 h。然后將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后，收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌兩次，并在冷的70%乙醇中在4 ℃下固定過(guò)夜。在PBS中再水化15 min后，將細(xì)胞在黑暗中用碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液染色30 min。此外，根據(jù)制造商的說(shuō)明，用膜聯(lián)蛋白(Annexin)-VFITC和PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)HEp-2細(xì)胞中HSV-1活性的影響為評(píng)估BE對(duì)HEp-2細(xì)胞中HSV-1的活性影響，采用qRT-PCR檢測(cè)HEp-2細(xì)胞中HSV-1感染相關(guān)基因(包括gD、ICP-4、ICP-8 和ICP-27)的mRNA表達(dá)情況。如Fig 1所示，與對(duì)照組比較，HSV-1感染組及不同濃度BE組gD、ICP-4、ICP-8和ICP-27的mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.01)。與感染組比較，各BE濃度組gD、ICP-4、ICP-8和ICP-27的mRNA表達(dá)水平均被抑制，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，且均隨BE濃度的升高呈濃度依耐性降低，其中高濃度組(15 μmol·L-1)抑制最明顯(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BE可以降低感染HSV-1的HEp-2的病毒活性。

2.2 黃連素對(duì)HSV-1感染的HEp-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響細(xì)胞活性與凋亡率可以直觀(guān)反映細(xì)胞的生物學(xué)行為，為了驗(yàn)證BE對(duì)HSV-1感染的HEp-2細(xì)胞的影響，采用CCK-8與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞的活性與凋亡率。如Fig 2所示，HSV-1感染組活性為5組中最低，而凋亡率最高(P<0.05)，對(duì)照組活性為5組中最高，凋亡率最低(P<0.05)；與HSV-1感染組比較，低、中、高濃度BE組隨濃度升高細(xì)胞活性隨之升高，而凋亡率也隨之降低，且都呈濃度依耐性變化(P<0.05)。上述結(jié)果表明，BE可以抑制HSV-1感染的HEp-2的凋亡，提升其活性。

Fig 1 BE affects HSV-1 activity in HEp-2 cells

Fig 2 BE affects biological behavior of HSV-1 infected HEp-2 cells

2.3 黃連素對(duì)HSV-1感染HEp-2細(xì)胞分子途徑分析采用qRT-PCR檢測(cè)HEp-2細(xì)胞中LncRNA NRAV、miR-299-3p、RAB5C mRNA的表達(dá)水平，驗(yàn)證BE影響HSV-1感染的HEp-2細(xì)胞分子途徑。結(jié)果如Fig 3所示，對(duì)照組LncRNA NRAV與RAB5C mRNA為5組中最低，miR-299-3p為最高，與對(duì)照組比較，HSV-1感染細(xì)胞后LncRNA NRAV與RAB5C mRNA表達(dá)明顯增加，而miR-299-3pmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。而B(niǎo)E干預(yù)的3組細(xì)胞中，高濃度BE組LncRNA NRAV與RAB5C mRNA最低，其次為中濃度BE組、低濃度BE組(P<0.05)，miR-299-3p則與之相反(P<0.05)。由此可知，BE可能通過(guò)抑制LncRNA NRAV與RAB5C，促進(jìn)miR-299-3p影響HSV-1的對(duì)HEp-2的感染能力。

2.4 LncRNA NRAV、miR-299-3p、RAB5C對(duì)感染HSV-1的HEp-2細(xì)胞的影響進(jìn)一步研究分子途徑，使用CCK-8與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染lncRNA NRAV高表達(dá)pcDNA3.1質(zhì)粒(pcDNA3.1-NRAV)、lncRNA NRAV short-hairpin RNA質(zhì)粒(sh-lncRNA NRAV)以及陰性對(duì)照NC-lncRNA NRAV的HEp-2細(xì)胞，RAB5C高表達(dá)pcDNA3.1質(zhì)粒(pcDNA3.1-RAB5C)、RAB5C short-hairpin RNA質(zhì)粒(sh-RAB5C)以及陰性對(duì)照NC-RAB5C的HEp-2細(xì)胞，以及miR-299-3p模擬物序列(mimics-miR-299-3p)、miR-299-3p抑制物序列(inhibition-miR-299-3p)、陰性對(duì)照NC-miR-299-3p的HEp-2細(xì)胞。如Fig 4A、B、C所示，升高LncRNA NRAV、RAB5C可以抑制感染HSV-1的HEp-2的活性，并促進(jìn)其凋亡；抑制miR-299-3p可以抑制感染HSV-1的HEp-2的活性，并促進(jìn)其凋亡，證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Fig 3 BE affects molecular pathways of HSV-1 infection of HEp-2 cells

Fig 4 LncRNA NRAV,miR-299-3p,RAB5C affect HEp-2 cells infected with

2.5 黃連素對(duì)HSV-1感染HEp-2細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響為了進(jìn)一步研究BE影響HSV-1感染HEp-2細(xì)胞信號(hào)通路的分子機(jī)制，Western blot檢測(cè)HEp-2細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。如Fig 5A所示，與對(duì)照組相比，HSV-1的感染上調(diào)了細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，與HSV-1組相比，BE干預(yù)的3組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白表達(dá)均隨濃度的升高呈濃度依耐性下降(P<0.05)。使用CCK-8與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)使用PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002干預(yù)以及無(wú)干預(yù)的HEp-2細(xì)胞，并感染HSV-1，如Fig 5B、C、D所示，LY294002組細(xì)胞活性高于無(wú)干預(yù)組，凋亡率則低于無(wú)干預(yù)組(P<0.05)。結(jié)果表明，BE可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活影響HSV-1對(duì)HEp-2的感染能力。

2.6 黃連素對(duì)HSV-1感染HEp-2細(xì)胞JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的影響同樣的方法驗(yàn)證對(duì)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的影響。如Fig 6A所示，HSV-1的感染上調(diào)了細(xì)胞中JNK、p38蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，給予BE后，JNK、p38蛋白表達(dá)水平隨濃度的升高呈濃度依耐性下降(P<0.05)。如Fig 6B、C、D所示，JNK/p38 MAPK信號(hào)通路激動(dòng)劑Anisomycin，細(xì)胞活性低于無(wú)干預(yù)組，凋亡率高于無(wú)干預(yù)組(P<0.05)。結(jié)果表明，BE可能通過(guò)抑制JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的激活影響HSV-1對(duì)HEp-2的感染能力。

3 討論

據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)告，90%的人口感染了不同類(lèi)型的皰疹病毒，這些病毒會(huì)潛伏或引起口腔和生殖器皰疹、結(jié)膜炎、皰疹濕疹和腦炎等疾病，尋找治療HSV-1的候選藥物很重要。黃連素對(duì)多種細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，是在尋找HSV-1治療候選藥物時(shí)必須考慮的一個(gè)因素。在之前的體外研究表明，黃連素對(duì)HSV-1感染的細(xì)胞具有劑量依賴(lài)性的抗病毒作用，而對(duì)正常細(xì)胞低毒性[16]，是一種相對(duì)安全有效的體外抑制HSV-1病毒的候選藥物。據(jù)報(bào)道JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的激活在HSV-1成功感染中發(fā)揮了重要作用[17]；BE聯(lián)合人參皂苷Rg3可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[18]。在本次研究中，首先，對(duì)HEp-2細(xì)胞中HSV-1的相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)，HSV-1感染組與對(duì)照組比較，HSV-1相關(guān)基因gD、ICP-4、ICP-8和ICP-27表達(dá)均升高，說(shuō)明HSV-1處于明顯的激活狀態(tài)，而B(niǎo)E的干預(yù)使gD、ICP-4、ICP-8和ICP-27表達(dá)均降低，并與濃度呈負(fù)相關(guān)，提示我們HSV-1的活性隨著B(niǎo)E濃度的升高受到了更多抑制。接著，細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)結(jié)果表明，在HSV-1的感染下，HEp-2的活性降低，凋亡率升高，說(shuō)明HSV-1通過(guò)促進(jìn)感染宿主細(xì)胞加速凋亡，BE的干預(yù)有效的抑制了凋亡加速，并改善細(xì)胞的活性。隨后，檢測(cè)了LncRNA NRAV、miR-299-3p與RAB5C的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在HSV-1中LncRNA NRAV、RAB5C均升高，而miR-299-3p則降低，提示三者可能參與了HSV-1感染的發(fā)病進(jìn)程，通過(guò)BE的干預(yù)，LncRNA NRAV、RAB5C則降低，而miR-299-3p升高；同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒的HEp-2細(xì)胞，升高LncRNA NRAV、RAB5C可以抑制感染HSV-1的HEp-2的活性，并促進(jìn)其凋亡，抑制miR-299-3p可以抑制感染HSV-1的HEp-2的活性，并促進(jìn)其凋亡，結(jié)果證實(shí)了三者間存在靶向調(diào)控關(guān)系。最后，研究結(jié)果顯示，PI3K/AKT信號(hào)通路和JNK/p38 MAPK信號(hào)通路在HSV-1感染后被激活，在BE干預(yù)后，其通路蛋白的表達(dá)也得到了抑制；進(jìn)一步通過(guò)信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑來(lái)驗(yàn)證通路在整個(gè)過(guò)程中的作用，抑制劑降低了細(xì)胞的凋亡，而激動(dòng)劑則促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，結(jié)果表明BE可能通過(guò)抑制信號(hào)通路的激活影響HSV-1的感染能力。

Fig 5 BE affects PI3K/AKT signaling pathway of HSV-1 infected HEp-2 cells

Fig 6 BE affects JNK/p38 MAPK signaling pathway of HSV-1 infected HEp-2 cells

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HEp-2細(xì)胞在HSV-1感染的狀態(tài)下，高表達(dá)的LncRNA NRAV、RAB5C靶向競(jìng)爭(zhēng)低表達(dá)的miR-299-3p，并通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路和JNK/p38 MAPK信號(hào)通路引起了細(xì)胞的加速凋亡，使用BE則抑制了細(xì)胞中HSV-1的活性，同時(shí)干預(yù)了上述分子途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而改善了HEp-2細(xì)胞的活性，并降低其凋亡。