成旭東,陳 婷，范 玲,林 夢，陳 汀，于棟偉，唐 樑，沈夕坤，黃玉宇

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215101)

肺癌是臨床發(fā)病率、死亡率最高的癌癥[1]。雖然過去的幾十年中在外科手術(shù)技術(shù)，放化療和免疫治療方面取得了長足的進步，肺癌的1年相對生存率已顯著提高(從34%增至47%)，但是IV期患者的5年相對生存率已降至4%。而61%肺癌患者被診斷時已經(jīng)是Ⅲ或Ⅳ期[2]。因此亟需尋找合適的治療肺癌的有效方法。

腫瘤血管生成與新血管的形成有關(guān)，新血管從血液中提供氧氣和營養(yǎng)。不受控制的血管生成為腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利條件[3]。腫瘤細胞是由微環(huán)境驅(qū)動的。微環(huán)境分泌與血管內(nèi)皮細胞受體結(jié)合的多種促血管生成細胞因子。這導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化，導(dǎo)致腫瘤細胞異常增殖和遷移[4]。因此，在臨床實踐中，血管生成可以代表針對腫瘤的有效治療靶標。VEGF家族是參與腫瘤血管生成的主要的細胞因子。腫瘤細胞分泌的炎性細胞因子激活了細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]。因此，具有抑制腫瘤微環(huán)境炎性因子，抑制腫瘤血管生成的化合物可能具有良好的抑制腫瘤的效果。

和厚樸酚(honokiol，HNK)是從木蘭植物的葉子和樹皮中分離出來的木脂素。HNK具有廣泛的藥理作用，例如神經(jīng)保護作用和抗炎作用。近年來，HNK阻斷腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，控制腫瘤細胞遷移和侵襲的能力備受關(guān)注[6]。HNK對乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等癌癥均具有一定的抑制作用[7]。因此，本研究探討了HNK對腫瘤微環(huán)境炎性因子誘導(dǎo)的肺癌細胞血管生成的作用及潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 H460細胞系獲自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。HUVEC細胞購自美國ATCC。

1.1.2藥物與試劑 HNK(純度>99%)購自中成都曼思特生物科技有限公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒，貨號C0038)、重組人IL-1β(貨號：P6470)、RIPA裂解液(貨號：P0013B)、磷酸化蛋白酶抑制劑(貨號：P1081)、BCA蛋白定量檢測試劑盒(貨號：P0012)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號：P0015)購自碧云天生物技術(shù)有限公司。多聚甲醛(貨號：C104190)和Triton X-100(貨號：T109027)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BD Matrigel基質(zhì)膠(貨號：356234)購自美國BD 公司。Transwell小室(貨號：CLS3470)購自美國Corning公司。RNA提取液(貨號：G3013)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：G3330)、SYBR試劑盒(貨號：G3322)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。胎牛血清購自Gibco公司(貨號10099-141)?？贵wVEGF(貨號：bs-0279R)，NF-κB p65(貨號：bs-0465R)，p-IκBα(貨號：bs-2513R)，IκBα(貨號：bs-1287R)，p-IKKα(貨號：bs-5399R)和IKKα(貨號：bs-4880R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。GAPDH(貨號：A19056)由武漢愛博泰克生物科技有限公司提供。蛋白Marker(貨號：26616)購自Thermo公司。兔二抗和鼠二抗購自美國Jackson公司。常用試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3主要儀器 Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DMIL倒置顯微鏡(德國徠卡公司)；IX73熒光倒置光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)；Multifuge臺式高速冷凍型微量離心機(美國Thermo Fisher公司)；Stepone plus熒光定量PCR儀 (美國ABI公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；ME55/02電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Direct-Q 3純水儀(美國Millipore公司)；Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；Eco-Mini電泳儀(德國耶拿公司)；GelDoc XR Biorad 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1CCK-8測定細胞活力 取對數(shù)生長期的人肺癌H460細胞，以1×103細胞/孔的密度接種在96孔板中，加入不同劑量的HNK(0、5、10、20、30、40或50 μmol·L-1)處理24、48和72 h。以含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基作為對照組。根據(jù)說明書將10 μL CCK-8溶液加入每個孔中，并在37 ℃下孵育4 h。使用酶標儀在450 nm的波長處測量吸光度。根據(jù)說明書公式計算細胞存活率。

1.2.2免疫熒光檢測H460細胞VEGF表達 將H460細胞接種于帶有載玻片的24孔板(1×105細胞/孔)中，并孵育24 h。用0.3 nmol·L-1的IL-1誘導(dǎo)H460細胞24 h，再加入10 μmol·L-1HNK溶液培養(yǎng)24 h，并用4%多聚甲醛固定15 min。用0.3%Triton X-100透化20 min，5%BSA封閉1 h，VEGF一抗4 ℃下孵育過夜。PBST洗片后，避光條件下FITC熒光二抗孵育1 h，然后DAPI染核。熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.3實時定量PCR 測定H460細胞VEGF mRNA的表達 收集對數(shù)期生長的H460細胞，按5×105個/孔加入6孔板中，用0.3 nmol·L-1的IL-1誘導(dǎo)H460細胞24 h，再加入5、10、20 μmol·L-1HNK溶液培養(yǎng)24 h。利用TRIzol試劑提取H460細胞的RNA總量。隨后，使用定量SYBR Green PCR試劑盒進行實時熒光定量。引物由武漢Servicebio公司合成，內(nèi)參為GAPDH。使用比較Ct(2-ΔΔCt)進行VEGF mRNA數(shù)據(jù)分析。RT-PCR中使用的引物序列見Tab 1。

Tab 1 PCR primer sequence

1.2.4Western blot檢測細胞蛋白水平的表達 用0.3 nmol·L-1的IL-1誘導(dǎo)H460細胞24 h，再加入5、10、20 μmol·L-1HNK溶液孵育H460細胞24 h。收集細胞，用RIPA緩沖液裂解10 min，4 ℃和14 000 r·min-1下離心10 min。以BSA為標準，BAC法測定蛋白濃度。每組30 μg蛋白10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶中封閉2 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后，室溫下孵育二抗1 h。孵育后，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影，分析各蛋白條帶相對灰度值。

1.2.5HUVEC細胞劃痕試驗 取對數(shù)生長期的HUVEC細胞接種在含6孔板中，并培養(yǎng)24 h，直到形成單層融合細胞。用200 μL無菌移液器吸頭劃兩條直線，PBS洗去細胞和碎片。用0.3 nmol·L-1的IL-1誘導(dǎo)H460細胞24 h，再加入10 μmol·L-1HNK和或PDTC培養(yǎng)H460細胞的條件培養(yǎng)基。使用倒置顯微鏡在0 h和24 h拍攝劃痕的相同區(qū)域的代表性圖像。測量劃痕兩端之間的距離，采用如下公式計算24 h細胞遷移率。

1.2.6HUVEC細胞侵襲測定 收集HUVEC細胞，無血清培養(yǎng)基制成1×108L-1的細胞懸液，接種在transwell上腔室中，加入IL-1誘導(dǎo)后HNK和或PDTC處理過的H460細胞的條件培養(yǎng)基中。下腔加入600 μL包含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h。取出小室，擦去上室中未遷移的HUVEC細胞后，將遷移的細胞甲醇固定，并用結(jié)晶紫溶液染色20 min。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，拍攝并計算細胞數(shù)目。

1.2.7HUVEC細胞毛細管形成試驗 將50 μL基質(zhì)膠涂在96孔板中，并在37 ℃孵育30 min以固化。將用HNK和或PDTC處理的H460細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVEC(1×104細胞/孔)接種并孵育24 h。通過顯微鏡(Zeiss，Oberkochen，德國)觀察毛細管。通過計數(shù)閉環(huán)或促血管生成結(jié)構(gòu)來評估毛細管的形成。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 HNK對H460細胞增殖活性的影響不同濃度HNK作用于人肺癌H460細胞24、48、72 h，采用CCK-8測定H460細胞增殖。結(jié)果如Fig 1A所示，隨著HNK濃度的升高，其對H460細胞增殖的抑制明顯增加(P<0.05)。表明HNK能夠明顯抑制H460細胞增殖，并且具有濃度和時間依賴性。計算得到不同時間HNK作用H460的IC50值，24 h為22.82 μmol·L-1，48 h為15.69 μmol·L-1，72 h為11.83 μmol·L-1。因此選擇最大濃度為20 μmol·L-1的HNK處理24 h作為后續(xù)實驗的條件。

2.2 HNK對IL-1誘導(dǎo)的H460細胞增殖活性的影響采用0.3 nmol·L-1IL-1處理H460細胞，模擬腫瘤微環(huán)境中的炎癥狀態(tài)的刺激作用。結(jié)果表明，IL-1明顯提高了H460細胞的增殖能力(P<0.05)。同時可以觀察到隨著HNK濃度的升高，其對IL-1誘導(dǎo)的H460細胞增殖的抑制明顯增加(P<0.05)(Fig 1B)。結(jié)果表明，HNK可以以時間和劑量依賴性方式降低肺癌細胞的活力。

2.3 HNK對IL-1誘導(dǎo)的H460細胞中VEGF mRNA水平的影響RT-PCR測定H460細胞中VEGF mRNA的表達水平。結(jié)果表明，IL-1明顯增加了H460細胞中VEGF的mRNA水平，而HNK以濃度依賴的方式下調(diào)VEGF的mRNA表達(Fig 2)。

2.4 HNK對IL-1誘導(dǎo)的H460細胞中VEGF蛋白水平的影響Western blot結(jié)果表明，IL-1明顯增加了H460細胞中VEGF蛋白的表達水平。加入HNK后，VEGF的表達水平明顯降低，并且呈劑量依賴關(guān)系(Fig 3)。

2.5 HNK對IL-1誘導(dǎo)的H460細胞中VEGF免疫熒光強度的影響如Fig 4，免疫熒光實驗中，H460細胞受到IL-1刺激后VEGF熒光強度明顯增強，10 μmol·L-1HNK處理后VEGF熒光強度明顯降低。

Fig 1 Inhibition of HNK on cell viability of H460 cells

Fig 2 Inhibition of HNK on VEGF mRNA levels in H460 cells

2.6 HNK對NF-κB信號通路蛋白的影響采用Western blot測定HNK對H460細胞中NF-κB信號通路。結(jié)果表明，IL-1誘導(dǎo)的H460細胞中，p-NF-κB/p65、p-IκBα和p-IKKα表達明顯增加，NF-κB/p65、IκBα和IKKα表達無明顯變化。加入HNK后，p-NF-κB/p65、p-IκBα和p-IKKα表達水平明顯降低。并且隨著HNK濃度增加，p-NF-κB/p65、p-IκBα和p-IKKα表達抑制越明顯。同時，HNK對NF-κB/p65、IκBα和IKKα表達影響不明顯(Fig 5)。

Fig 3 Effect of HNK on VEGF protein levels in H460 cells

Fig 4 Effect of HNK on VEGF expression in H460 cells detected by immunofluorescence

2.7 PDTC驗證HNK通過NF-κB信號通路影響VEGF mRNA的表達應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC驗證NF-κB通路在HNK抑制VEGF中的調(diào)控作用。實驗結(jié)果表明10 μmol·L-1PDTC降低H460細胞中IL-1誘導(dǎo)的VEGF的mRNA水平，并且HNK和PDTC的組合產(chǎn)生了更明顯降低VEGF mRNA表達水平的效果(Fig 6)。

2.8 PDTC驗證HNK通過NF-κB信號通路影響VEGF蛋白的表達Western blot結(jié)果表明，HNK和PDTC同樣具有抑制IL-1誘導(dǎo)的VEGF表達，HNK與PDTC共同作用可以更明顯地抑制VEGF表達水平(Fig 7)。結(jié)果證實了HNK通過NF-κB信號通路下調(diào)了用IL-1預(yù)處理的細胞中VEGF的表達水平。

Fig 5 Effect of HNK on NF-κB signaling pathway protein expression

Fig 6 HNK inhibited VEGF mRNA levels by NF-κB signaling pathway

2.9 HNK對HUVEC細胞增殖的影響不同濃度HNK作用于HUVEC細胞24 h，采用CCK-8測定HUVEC細胞增殖的影響。結(jié)果如Fig 8A所示，隨著HNK濃度的升高，其對HUVEC細胞增殖的抑制增加，只有當HNK濃度高于20 μmol·L-1時才差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 7 HNK inhibited VEGF protein levels by NF-κB signaling pathway

Fig 8 Inhibition of HNK on cell viability of HUVECs

IL-1誘導(dǎo)H460條件培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)HUVEC細胞異常增殖，HNK與PDTC作用H460細胞的條件培養(yǎng)基對HUVEC具有一定抑制作用，當HNK和PDTC共同作用的條件培養(yǎng)基對HUVEC具有明顯的抑制作用(P<0.01)(Fig 8B)。

2.10 HNK對HUVEC細胞橫向遷移的影響劃痕試驗結(jié)果如Fig 9所示，IL-1誘導(dǎo)H460條件培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)HUVEC細胞橫向遷移，HNK與PDTC作用H460細胞的條件培養(yǎng)基對HUVEC橫向遷移具有一定抑制作用，當HNK和PDTC共同作用的條件培養(yǎng)基對HUVEC的橫向遷移具有明顯的抑制作用(P<0.01)。

Fig 9 HNK inhibited HUVEC lateral migration through NF-κB signaling pathway

2.11 HNK對HUVEC細胞縱向遷移的影響Transwell試驗結(jié)果見Fig 10，IL-1誘導(dǎo)H460條件培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)HUVEC細胞縱向遷移，HNK與PDTC作用H460細胞的條件培養(yǎng)基對HUVEC縱向遷移具有一定抑制作用，當HNK和PDTC共同作用的條件培養(yǎng)基對HUVEC的縱向遷移具有明顯的抑制作用(P<0.01)。

2.12 HNK對HUVEC細胞小管生成的影響如Fig 11所示，IL-1誘導(dǎo)的H460細胞培養(yǎng)基明顯增加HUVEC的毛細管形成，而單獨用PDTC或HNK處理的H460細胞的條件培養(yǎng)基加PDTC則可以抑制小管形成。HNK和PDTC共同作用的條件培養(yǎng)基對HUVEC的小管生成具有明顯的抑制作用(P<0.01)。

Fig 10 HNK inhibited longitudinal migration of HUVECs through NF-κB signaling pathway

3 討論

抑制血管生成是NSCLC靶向治療的重要組成部分，受到了越來越多的臨床關(guān)注[8]。腫瘤微環(huán)境中各種炎癥刺激促進異常血管生成是腫瘤惡性病變的關(guān)鍵事件[9]。本研究證實了HNK可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制腫瘤的血管生成。

IL-1是由腫瘤細胞或微環(huán)境中產(chǎn)生的促炎性因子之一，可以使炎癥和免疫力之間的平衡趨向于誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)[10]。IL-1與肺癌、卵巢癌、乳腺癌和其他癌細胞的黏附、侵襲和血管生成有關(guān)[11-12]。IL-1可以誘導(dǎo)H460細胞的異常增殖。HNK對IL-1誘導(dǎo)的H460具有明顯的抑制作用。這些結(jié)果為HNK的后續(xù)評估和抗血管生成作用提供了基礎(chǔ)。

VEGF是腫瘤血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，可以通過表達癌基因，各種生長因子或缺氧來上調(diào)VEGF。VEGF通過直接作用于內(nèi)皮細胞來誘導(dǎo)血管生成。此外，已經(jīng)證明VEGF可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞浸潤基礎(chǔ)基質(zhì)并形成毛細血管樣小管[13]。VEGF增強內(nèi)皮細胞的趨化性以及纖溶酶原激活物和膠原酶的表達[14]。因此，VEGF是血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，因為它促進血管生長和重構(gòu)，并促進內(nèi)皮細胞的有絲分裂和存活。HNK抑制H460細胞中VEGF的合成，抑制腫瘤血管生成。

文獻研究表明，抑制NF-κB調(diào)節(jié)VEGF的表達水平[15]。在缺氧胰腺腫瘤中，PKM2與NF-κB/p65相互作用以激活HIF-1α及其靶基因VEGF的轉(zhuǎn)錄，從而增加血管的形成，從而促進腫瘤的生長[16]。NF-κB可以調(diào)節(jié)HIF-1α并影響乳腺癌中VEGF的表達[17]。NF-κB天然抑制劑如山奈酚已被證明可通過ERK-NF-κB-cMyc-p21-VEGF途徑抑制卵巢癌細胞的血管生成[18]。HNK抑制NF-κB信號通路主要蛋白NF-κB/p65、IκBα和IKKα激活，降低肺癌細胞中VEGF的表達。

總而言之，這項研究的數(shù)據(jù)表明，HNK可以降低肺癌的體外血管生成，其潛在機制是NF-κB信號通路。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究HNK在NSCLC的臨床治療提供了科學(xué)依據(jù)。