何 爽，杜玉梅，唐加峰，黃世瑩，張 滔，盧睿瑾，李 靜，徐 航，陳地龍，

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、2.公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016；3.重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶 404120)

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且發(fā)病率和死亡率均居于首位[1]。肺癌按照其病理類(lèi)型可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌兩種，其中非小細(xì)胞肺癌約占85%[2]。目前，對(duì)于NSCLC的治療策略包括手術(shù)、放療化療、光動(dòng)力療法、分子靶向治療等，但由于其早診率低，化療有效率低且副作用大、易耐藥和復(fù)發(fā)率高等導(dǎo)致總體治療效果不理想，五年生存率僅15%，因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療藥物[3]。

近年來(lái)，天然草藥化合物作為單一療法或者聯(lián)合放化療在治療各種腫瘤中取得了喜人的成果。鴉膽子苦醇(brusatol，BRU)是從中藥鴉膽子中提取得到的一種苦木內(nèi)酯類(lèi)化合物[4]，研究表明，鴉膽子苦醇能夠作為核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid2 related factor 2，Nrf2)的抑制劑，能以Keap1獨(dú)立的方式增強(qiáng)Nrf2的泛素化和降解來(lái)降低Nrf2的蛋白水平[5-6]，從而增強(qiáng)多種癌細(xì)胞如大腸癌、肺癌、膽囊癌、胰腺癌對(duì)各種化療藥物如順鉑、紫杉醇、吉他西濱、5-氟尿嘧啶等的敏感性[7]。此外，BRU對(duì)癌細(xì)胞的作用靶標(biāo)非常廣泛，如PI3K、Akt、JNK、p38、MAPK等均受到BRU的影響[8-9]。同時(shí)，鴉膽子苦醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用，包括肝細(xì)胞癌、大腸癌、胰腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和鼻咽癌等等[8-9]。而鴉膽子苦醇對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的作用及其機(jī)制的研究卻報(bào)道較少。在本研究中，我們選用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299細(xì)胞系作為研究對(duì)象，旨在探討鴉膽子苦醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌的具體作用方式及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑鴉膽子苦醇(BRU，純度 ≥98%，B26016)購(gòu)自上海源葉科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8，HY-K0301)購(gòu)自MCE公司；胎牛血清(10270-106)、蛋白酶抑制劑(IPVH00010)、青-鏈霉素(10378016)、RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)1640TS)均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，C0221A)、二甲基亞砜(DMSO，ST038)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型，P0010)、細(xì)胞凋亡-Hoechst33258染色試劑盒(C1017)、一抗抗體Bcl-xL(AB126)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(03516100)、雙色預(yù)染蛋白Marker(WJ101)、無(wú)蛋白快速封閉液(PS108)均購(gòu)自雅酶生物；一抗抗體Bax(5023S)、Bcl-2(4223S)、GAPDH(5174S)、β-actin(3700S)、Histone H3(4499S)、PI3K(4257T)、Akt(4691S)、p-Akt(4058S)、NF-κB-p65(4058S)、GADD45α(4632S)、二抗抗體(7072S、9076S)均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞株H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 儀器超凈工作臺(tái)(賽默飛世爾科技)；低速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(北京龍方科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)將H1299細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素與鏈霉素混合)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底部約70%時(shí)進(jìn)行傳代操作。

1.5 CCK-8法檢測(cè)BRU處理對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，以5×107·L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分3組：分別為未接種細(xì)胞的空白組，接種細(xì)胞未加入BRU常規(guī)培養(yǎng)的對(duì)照組，接種細(xì)胞并含不同濃度BRU(31.25、62.5、125、250、500、10 00 nmol·L-1)的加藥組。分別培養(yǎng)各組細(xì)胞12、24、48 h后棄舊培養(yǎng)基，各孔加入100 μL含10% CCK-8的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基后繼續(xù)在孵箱中孵育兩小時(shí)，在450 nm吸光度測(cè)定各孔吸光度值(A)，計(jì)算抑制率,抑制率/%=(A對(duì)照組-A加藥組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%，同時(shí)計(jì)算IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 EdU法檢測(cè)BRU處理對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，以1.5×107·L-1接種于6孔板，2 mL/孔。將實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組：接種細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)不加入藥物；低藥物組：處理藥物濃度為0.3 μmol·L-1；高藥物組：藥物濃度為0.6 μmol·L-1。于孵箱中培養(yǎng)24 h后，按照BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作后使用倒置熒光顯微鏡拍攝圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BRU處理對(duì)H1299細(xì)胞克隆形成能力的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，顯微鏡計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度以每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后棄舊培養(yǎng)液。分3組，加藥處理細(xì)胞后于孵箱培養(yǎng)24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約14 d，每3 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)6孔板中形成明顯的集落時(shí)終止培養(yǎng)，棄舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次后加入4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞15 min，棄固定液后PBS洗滌兩次加入結(jié)晶紫染料染色5 min，流水緩慢沖洗多余染色液，使用倒置熒光顯微鏡拍照后用軟件ImageJ統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BRU處理對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，以1.5×107·L-1接種于6孔板，每孔2 mL。此實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為常規(guī)培養(yǎng)不加入藥物的對(duì)照組，藥物濃度為0.3、0.6 μmol·L-1的加藥組。加入藥物后細(xì)胞于孵箱中培養(yǎng)24 h，24 h后棄舊培養(yǎng)基，使用PBS洗滌兩次，加入固定液固定。棄固定液后，使用PBS洗滌兩次，加入Hoechst 33258染液染色5 min。棄染液后PBS洗滌3次，使用倒置熒光顯微鏡拍照，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BRU處理對(duì)H1299細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，以每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后棄舊培養(yǎng)基，加入含0、0.3、0.6 μmol·L-1BRU的RPMI1640完全培養(yǎng)基于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄舊培養(yǎng)液，使用PBS清洗兩次后用胰酶消化液消化細(xì)胞，離心后用PBS離心清洗細(xì)胞，反復(fù)兩次。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)BRU處理H1299細(xì)胞后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平將細(xì)胞分為3組，分別加入藥物處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白與胞質(zhì)、胞核蛋白。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離各組蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液于常溫下封閉20 min，4 ℃孵育一抗Bcl-xL、Bax、Bcl-2、caspase3、cleaved-caspase3、Gadd45α、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB-p65、GAPDH、β-actin、Histone H3過(guò)夜。TBST(1×)清洗3次，二抗室溫孵育1 h，TBST(1×)清洗3次，于暗室使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有的計(jì)量資料數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析,兩組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BRU抑制H1299細(xì)胞的增殖CCK-8結(jié)果(Fig 1)顯示，不同濃度的BRU作用于H1299細(xì)胞12、24、48 h后，與對(duì)照組相比，H1299細(xì)胞的增殖明顯被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且抑制作用隨著B(niǎo)RU劑量和時(shí)間的增加而增強(qiáng)。24與48 h的IC50分別為0.69和0.25 μmol·L-1，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.6 μmol·L-1的BRU作為細(xì)胞的最高處理濃度。

Fig 1 Inhibitory effect of brusatol on H1299 cells by CCK-8 n=3 )

EdU如Fig 2A顯示，使用藥物BRU處理H1299細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞中EdU的摻入明顯降低，并且隨著藥物濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 2B顯示，使用BRU處理H1299細(xì)胞后，藥物處理組細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比，藥物處理組的克隆形成率分別下降至55.7%、33.8%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 BRU誘導(dǎo)H1299細(xì)胞發(fā)生凋亡Hoechst 33258凋亡染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Fig 3A，如圖可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核為規(guī)則的橢圓形，并且呈彌散均勻的淡藍(lán)色；而使用不同濃度的BRU處理H1299細(xì)胞24 h后，H1299細(xì)胞核出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)不清晰，細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)致密濃染且顏色有些發(fā)白等典型細(xì)胞凋亡特征。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)Fig 3B，流式凋亡圖共分4個(gè)象限，左上象限為壞死細(xì)胞、左下象限為正?；罴?xì)胞、右上象限晚期凋亡細(xì)胞、右下象限為早期凋亡細(xì)胞，所以細(xì)胞的凋亡率應(yīng)該為右上、右下象限百分率之和。藥物處理組的細(xì)胞凋亡率分別上升到11.3%和21.7%，明顯高于對(duì)照組的4.9%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 2 Results of EdU staining (A,×200)and clone formation assay ( n=3 )

Fig 3 Results of Hoechst 33258 apoptosis staining (A,×200)and the apoptosis results of flow cytometry n=3)

Fig 4 Expression levels of apoptosis proteins in H1299 cells n=3 )

2.3 BRU影響H1299細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)使用不同濃度的BRU處理H1299細(xì)胞24 h后，提取蛋白質(zhì)，Western blot結(jié)果見(jiàn)Fig 4，BRU處理組細(xì)胞中抗凋亡標(biāo)記物Bcl-xL、Bcl-2、caspase-3的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組且隨著B(niǎo)RU的濃度增加而降低；而DNA損傷與周期阻滯標(biāo)記物Gadd45α、凋亡標(biāo)記物Bax、cleaved-caspase-3的蛋白質(zhì)水平明顯高于對(duì)照組，且呈BRU濃度依賴(lài)性增加(P<0.05)。

2.4 BRU抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活并抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)為了研究BRU影響H1299細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)水平及NF-κB在胞核和胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果如Fig 5所示，使用不同濃度的BRU處理細(xì)胞后，磷酸化PI3K與p-Akt的蛋白質(zhì)水平均劑量依賴(lài)性降低，且細(xì)胞核中p65的蛋白質(zhì)水平降低，而細(xì)胞質(zhì)中p65的蛋白質(zhì)水平上升。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌作為一種發(fā)病率和死亡率在全球都居于首位的呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，早期很難被確診，患者一經(jīng)確診往往已經(jīng)處于中晚期[10]。對(duì)于早期非小細(xì)胞肺癌，手術(shù)切除治療是其首選方案，但往往伴隨著高風(fēng)險(xiǎn)與較差的預(yù)后，患者術(shù)后生存率很低。而對(duì)于不可切除的中晚期非小細(xì)胞肺癌，鉑類(lèi)藥物化療仍是一線治療方案，盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出其它的治療藥物如吉非替尼、吉他西濱等，但嚴(yán)重的副作用與耐藥限制了這些藥物的療效，所以當(dāng)前研究的關(guān)鍵是尋找一種安全高效的NSCLC治療藥物。

Fig 5 Protein expression of PI3K/Akt signaling pathway (A)and NF-κB-p65 (B,C)components in H1299 cells n=3)

大量研究表明，在放化療治療癌癥的過(guò)程中，常使用中草藥來(lái)增加其療效并減少這些療法引起的副作用和并發(fā)癥，中草藥及其提取物在腫瘤治療方面表現(xiàn)出了極大的潛力[11]。BRU作為一種潛在的抗癌藥物，大量的研究已經(jīng)證實(shí)其優(yōu)秀的抗癌能力。例如，BRU通過(guò)抑制Nrf2途徑增強(qiáng)了順鉑在突變的KrasG12D誘導(dǎo)的肺癌小鼠模型中抗腫瘤功效[12]，還能通過(guò)促進(jìn)活性氧產(chǎn)生和增強(qiáng)DNA損傷來(lái)增強(qiáng)A549細(xì)胞的放射敏感性[13]。然而，BRU對(duì)肺癌的抗癌作用研究多集中于作為化療或者放療中的增敏劑，作為單一療法對(duì)肺癌的潛在作用和機(jī)制仍有待深入研究。因此，本研究選擇非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞系來(lái)探究BRU對(duì)其的作用及其可能的機(jī)制。首先，CCK-8法結(jié)果顯示，BRU呈濃度和劑量依賴(lài)地抑制了H1299細(xì)胞的增殖，并且BRU的作用濃度較低，表明H1299細(xì)胞對(duì)BRU的敏感性較高。同時(shí)，克隆形成實(shí)驗(yàn)與EdU染色實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了BRU呈濃度依賴(lài)地抑制H1299細(xì)胞的增殖。

腫瘤細(xì)胞可通過(guò)凋亡信號(hào)的失調(diào)，尤其是抗凋亡系統(tǒng)的激活來(lái)逃避凋亡或程序性細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致惡性增殖，治療抗性和癌癥復(fù)發(fā)[14]。因此，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是許多抗癌藥物的重要作用方式之一。Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BRU誘導(dǎo)了H1299細(xì)胞的凋亡，同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也證實(shí)了BRU能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著藥物濃度升高而增加。因此我們進(jìn)一步探尋了BRU抑制H1299細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

NF-κB是一種普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，具有五個(gè)不同的同源和異二聚體復(fù)合蛋白，其中一個(gè)p65亞基與p50亞基形成p50/p65異二聚體在腫瘤細(xì)胞存活、增殖和分化及其他過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[15]。當(dāng)p50/p65異二聚體被釋放入核后，p50亞基與DNA結(jié)合，而p65亞基進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活，誘導(dǎo)或抑制下游靶基因表達(dá)。生長(zhǎng)阻滯DNA損傷45(Gadd45)蛋白與Bcl-xL蛋白均受到NF-κB的調(diào)控。正常情況下，NF-κB抑制癌細(xì)胞中Gadd45α的表達(dá)，這對(duì)于癌細(xì)胞的存活起著至關(guān)重要的作用，且Gadd45α與癌細(xì)胞周期阻滯也密切相關(guān)。Bcl-xL作為一種凋亡抑制蛋白，在癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控中同樣也起著關(guān)鍵的作用。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BRU能明顯降低H1299細(xì)胞核中p65的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，增加胞質(zhì)中的p65蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，這說(shuō)明BRU阻止了H1299細(xì)胞中p65蛋白質(zhì)的核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而上調(diào)Gadd45α蛋白質(zhì)表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-xL的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，最終抑制腫瘤增殖并促進(jìn)其凋亡。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路在調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化、血管生成和凋亡中同樣發(fā)揮重要作用，而PI3K/Akt信號(hào)通路的持續(xù)激活將會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)BRU處理能降低磷酸化PI3K與Akt的蛋白質(zhì)水平，這表明BRU能阻止PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。Bcl-2家族調(diào)控著細(xì)胞的凋亡，Bcl-2與Bax作為重要的抗凋亡和促凋亡蛋白，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2或下調(diào)Bax的蛋白質(zhì)表達(dá)水平來(lái)阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制胱天蛋白酶家族蛋白(caspase)的活化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避死亡[17]。我們同樣發(fā)現(xiàn)，BRU處理能降低抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白質(zhì)水平，并增加促凋亡蛋白Bax與cleved-caspase-3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。研究已經(jīng)證實(shí)，PI3K/Akt通路的激活可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并抑制Bax、caspase-3等凋亡蛋白的激活，同時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)級(jí)聯(lián)是NF-κB上游的主要成分[18]。因此我們有理由相信，BRU通過(guò)抑制PI3K與磷酸化Akt的水平來(lái)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，阻止其下游分子p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)，上調(diào)Gadd45α的蛋白質(zhì)水平，從而抑制細(xì)胞的增殖；并同時(shí)通過(guò)降低抗凋亡蛋白Bcl-xL與Bcl-2，增加促凋亡蛋白Bax與cleved-caspase-3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平來(lái)協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，BRU能夠有效抑制H1299非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活并抑制p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本研究后續(xù)還需繼續(xù)深入探究?jī)蓚€(gè)問(wèn)題，一是BRU通過(guò)什么方式作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，二是BRU作為一種被大量研究證實(shí)的Nrf2抑制劑，在非小細(xì)胞肺癌中Nrf2與PI3K/Akt通路可能存在某種關(guān)聯(lián)。BRU作為一種潛在的抗癌藥物，在未來(lái)可能會(huì)展現(xiàn)出更廣泛的應(yīng)用前景，本研究可為后來(lái)研究人員提供部分參考價(jià)值。