周杰 張莉 張娟 凌清松 徐康立 楊書才

B 族鏈球菌（group B Streptococcus， GBS）學(xué)名無乳鏈球菌，能引起牛乳房炎，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)，故早期為獸醫(yī)界關(guān)注。隨著進一步研究發(fā)現(xiàn)該菌也能感染人類，尤其是孕產(chǎn)婦和新生兒。GBS常定植于陰道或直腸，妊娠期婦女的帶菌率可達(dá)到10%～35%[1-3]。GBS是圍生期孕婦感染的主要致病菌，易導(dǎo)致產(chǎn)褥感染、泌尿生殖道感染、敗血癥、胎膜早破、早產(chǎn)等，在新生兒群體可引起敗血癥、肺炎、腦膜炎等死亡率高的疾病[4-5]。一般而言，約一半的GBS定植孕婦通過母嬰垂直傳播將細(xì)菌傳播給新生兒，在沒有產(chǎn)前抗菌藥物預(yù)防的情況下，1%～2%的新生兒會出現(xiàn)GBS早發(fā)型感染[6]。因此在孕婦陰道/直腸中準(zhǔn)確可靠的篩查出GBS，并在生產(chǎn)時給予合適的抗菌藥物進行干預(yù)，是預(yù)防新生兒GBS早發(fā)型感染的關(guān)鍵。顯色平板是近些年興起的一種用于細(xì)菌培養(yǎng)的新型培養(yǎng)基，GBS顯色平板是在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了特異性的酶底物，GBS可以通過酶解作用釋放出顯色原而使菌落呈現(xiàn)紅色或紫紅色，而其他細(xì)菌在平板上呈現(xiàn)淡綠色或藍(lán)色等顏色。本研究擬通過比較顯色平板與血瓊脂平板對GBS的檢出效果，評價GBS顯色平板的性能，同時對檢出的陽性菌株進行耐藥性分析，為新生兒GBS感染合理抗菌藥物預(yù)防、治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年4-12月本院產(chǎn)科門診孕婦標(biāo)本1 143份，年齡18～45歲，孕35～37周，產(chǎn)科醫(yī)生按操作規(guī)程采集陰道/直腸拭子。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，且患者已簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定藥敏儀及配套鑒定、藥敏卡（法國生物梅里埃公司）、GBS增菌肉湯管（江門市凱琳貿(mào)易有限公司）、哥倫比亞血瓊脂平板（廣州市迪景微生物科技有限公司）、GBS顯色平板（鄭州安圖生物工程有限公司）、M-H血瓊脂平板（溫州市康泰生物科技有限公司）、藥敏紙片（英國OXOID公司）。

1.3 方法

用一次性棉拭子采集孕晚期孕婦陰道下1/3處的分泌物，再將同一拭子插入肛門內(nèi)1～3 cm，旋轉(zhuǎn)一圈后取出，1 h內(nèi)送實驗室。實驗室接到樣本后，將拭子放入GBS肉湯管，于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱增菌18～24 h。將增菌肉湯混勻，取一接種環(huán)分別接種血平板和GBS顯色平板，三區(qū)劃線后放35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。經(jīng)過24～48 h培養(yǎng)后，挑取血平板上灰色、周圍有或無β溶血環(huán)菌落進行涂片后革蘭染色，如顯微鏡下為革蘭陽性球菌，采用細(xì)菌鑒定儀進行鑒定；GBS顯色平板經(jīng)24～48 h培養(yǎng)后，從上面挑取紅色或紫紅色菌落轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，再經(jīng)24 h培養(yǎng)，采用細(xì)菌鑒定儀進行鑒定。經(jīng)鑒定為GBS菌株，采用全自動鑒定藥敏儀和配套藥敏卡進行藥敏試驗，對紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的菌株加做克林霉素誘導(dǎo)試驗（D試驗），如為陽性，判定為克林霉素誘導(dǎo)耐藥。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析和處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測GBS結(jié)果

1 143 例孕晚期孕婦陰道/直腸拭子在顯色平板上生長帶有紅色或紫紅色的菌落151株，經(jīng)鑒定146株為GBS，GBS陽性率為12.77%，5株非GBS菌株經(jīng)鑒定4株為溶血葡萄球菌，1株為糞腸球菌。將顯色平板上的GBS轉(zhuǎn)血瓊脂平板觀察，其中有12株為不溶血GBS。血瓊脂平板上檢測出115株GBS，GBS陽性率為10.06%，見表1。GBS顯色平板陽性率顯著高于血瓊脂平板，兩種方法陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.16，P=0.041）。

表1 GBS顯色平板與血瓊脂平板檢測結(jié)果比較（株）

2.2 藥敏結(jié)果

GBS對青霉素、萬古霉素2種抗菌藥物100%敏感；對四環(huán)素耐藥率最高，為82.88%；對紅霉素、克林霉素、左旋氧氟沙星的耐藥率分別為63.01%、56.85%、19.18%；對紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的GBS有8株D試驗陽性，表現(xiàn)出克林霉素誘導(dǎo)性耐藥，本次試驗還檢測出1株對利奈唑胺敏感性降低菌株，見表2。

表2 GBS對抗菌藥物的耐藥情況

3 討論

B族鏈球菌是革蘭陽性兼性厭氧球菌，常定植于女性下消化道和生殖道，是圍生期母嬰感染的重要致病菌。已有的研究分析顯示，不同地區(qū)的GBS篩查陽性率存在較大的差異，非洲地區(qū)孕婦GBS定植率為18.1%～26.7%，美洲地區(qū)為16.7%～22.7%，歐洲地區(qū)為16.1%～22.0%，東南亞地區(qū)為6.8%～15.3%[7]。美國CDC在2010年發(fā)布《圍產(chǎn)期B族鏈球菌相關(guān)疾病預(yù)防指南》建議對孕35～37周孕婦進行GBS篩查，對篩查陽性孕婦在生產(chǎn)時采取抗菌藥物預(yù)防，以降低新生兒感染率和死亡率[8]。

在我國，目前常規(guī)的產(chǎn)檢項目沒有包括孕晚期孕婦的GBS篩查，各醫(yī)院采取不同的方法進行檢查，導(dǎo)致文獻(xiàn)報道的孕晚期孕婦GBS的定植率差異較大。孟嬋等[9]采用PCR技術(shù)檢測GBS的陽性率為7.51%；李相會等[10]采用顯色平板檢測GBS的陽性率為6.30%，均未使用GBS肉湯管進行增菌。金嫻等[11]采用增菌后改良接種培養(yǎng)法檢測GBS的陽性率11.60%，與本研究結(jié)果相似。采用GBS肉湯管進行增菌是美國CDC指南中的核心要素，指南中指出，未使用肉湯管進行增菌可能漏掉50%的病例[8]。本次試驗通過先采用GBS肉湯管進行增菌，然后分別轉(zhuǎn)種GBS顯色平板和血瓊脂平板，陽性率分別為12.77%和10.06%，顯色平板篩查GBS陽性率顯著高于血瓊脂平板，分析原因可能有以下兩個方面：首先是標(biāo)本通過增菌后，只是單純地抑制了革蘭陰性桿菌，而陰道/直腸中的大量革蘭陽性球菌仍然存在，尤其是糞腸球菌和解沒食子酸鏈球菌，它們與不產(chǎn)溶血環(huán)GBS形態(tài)非常相似，在血瓊脂平板上很難區(qū)分，造成不產(chǎn)溶血環(huán)GBS的漏檢；其次是標(biāo)本中只含有少量的GBS，而含有大量糞腸球菌或其他鏈球菌時，標(biāo)本轉(zhuǎn)種在血瓊脂平板上面，只有少量的GBS在第一區(qū)和大量的其他細(xì)菌混合生長，由于競爭抑制，GBS溶血環(huán)不易產(chǎn)生，導(dǎo)致GBS和其他細(xì)菌不易區(qū)分而造成漏檢。本次分離出4株溶血葡萄球菌和1株糞腸球菌在GBS顯色平板上呈現(xiàn)淡粉紅色菌落，與GBS在顯色平板上生長呈現(xiàn)出紅色或紫紅色有很大區(qū)別，易于區(qū)分。本次還分離到3株在血瓊脂平板上生長呈黃色的GBS菌落，這與文獻(xiàn)[12]《全國臨床檢驗操作規(guī)程》中描述的GBS菌落在血瓊脂平板生長為灰色菌落有所區(qū)別，因此在分離到黃色菌落，也要想到有可能為GBS，以免造成漏檢。GBS顯色平板上生長的疑似GBS菌落必須轉(zhuǎn)種血平板上再進行鑒定，如果直接上機鑒定，機器常鑒定為停乳鏈球菌或假豕鏈球菌，這可能由于GBS在顯色平板上生長不充分造成的。

美國CDC在發(fā)布的指南中建議青霉素是產(chǎn)前預(yù)防GBS感染的首選藥物，對青霉素過敏的孕婦應(yīng)進行細(xì)菌藥敏試驗，若對紅霉素和克林霉素均為敏感或克林霉素誘導(dǎo)試驗陰性可以采用克林霉素治療，如果克林霉素耐藥或誘導(dǎo)試驗陽性需選用萬古霉素進行治療[8]。越來越多的研究報道指出GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥性在逐漸加重，Crespo-Ortiz等[13]對拉丁美洲醫(yī)院2個不同階段GBS感染的研究發(fā)現(xiàn)，GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥性有所增加，紅霉素和克林霉素的耐藥性從1994-2001年的2.8%和5.2%增加到2004-2012年的12.5%和9.4%。Genovese等[14]對孕婦陰道分離的3 494株GBS進行藥敏試驗，GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別是40.1%和31.2%。吳麗娟等[15]報道孕晚期孕婦定植的GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為69.73%和66.58%。本研究顯示孕晚期孕婦攜帶的GBS對青霉素和萬古霉素均敏感，對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別是63.01%和56.85%，與吳麗娟等[15]報道接近。由于克林霉素耐藥率超過了50%，提示其已經(jīng)不能作為經(jīng)驗用藥的抗菌藥物。本次還分離到1株對利奈唑胺敏感性降低GBS，通過查閱文獻(xiàn)，對利奈唑胺敏感性降低或耐藥菌株通常出現(xiàn)在糞腸球菌、葡萄球菌等細(xì)菌[16-17]，GBS出現(xiàn)對利奈唑胺敏感性降低，罕有報告，其機制還有待進一步研究。

綜上所述，篩查孕晚期孕婦陰道/直腸定植B族鏈球菌應(yīng)進行增菌；GBS顯色平板可有效避免其他細(xì)菌干擾，培養(yǎng)陽性率顯著高于血瓊脂平板，值得推廣應(yīng)用；GBS對青霉素依然保持高度敏感，可作為預(yù)防用藥；克林霉素耐藥率較高，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇性用藥。