向思曲，朱賢林，葉剛，王在平，楊敏

丙泊酚是一種常用的靜脈全身麻醉藥物，呈乳白色液體狀，作為一種臨床常用的麻醉劑，其有可能會引起患者認知功能下降，從而引起腦損傷，在注射過程中可以出現(xiàn)局部疼痛，是因藥物對血管產(chǎn)生刺激導(dǎo)致，在此時間段接受藥物刺激能夠?qū)δX的發(fā)育產(chǎn)生影響[1-2]。丙泊酚有起效迅速、誘導(dǎo)時間短、蘇醒快的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于外科臨床麻醉[3]。但有臨床研究顯示[4]，大腦早期接受丙泊酚暴露之后能夠?qū)е潞ｑR區(qū)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡，從而造成腦損傷，注射過程中如果給藥劑量偏大，或者和其他藥物協(xié)同，會引起低血壓和短暫性呼吸暫停。有臨床研究顯示[5]，磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號傳導(dǎo)通路能夠調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、代謝等各種過程?，F(xiàn)對SD大鼠進行丙泊酚麻醉，觀察PI3K/Akt通路在丙泊酚麻醉誘發(fā)大鼠腦損傷中的作用機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)研究對象：SD大鼠[河南省獸藥飼料監(jiān)察所；合格證號：SYXK(豫)2021-0012]30只，月齡5～11(8.19±2.35)個月，體質(zhì)量186～203(193.52±6.87)g，飼養(yǎng)環(huán)境為相對濕度45%～55%，溫度(21.23±4.46)℃，光照12 h/d環(huán)境下喂養(yǎng)1周。(2)試藥試劑：丙泊酚( 河北一品制藥有限公司)；PBS緩沖液(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司)。(3)儀器設(shè)備：玻璃麻醉箱(北京雙玉科技有限公司)，散射光濁度儀(杭州聯(lián)測自動化技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法 2020年3月—2021年4月在恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院進行丙泊酚麻醉誘發(fā)大鼠腦損傷實驗。大鼠30只按隨機數(shù)字表法分為對照組、2%丙泊酚組、4%丙泊酚組，各10只。將2%丙泊酚組、4%丙泊酚組大鼠分別置于玻璃麻醉箱內(nèi)，并將浸潤2%丙泊酚、4%丙泊酚棉球的小燒杯50 ml分別置于玻璃麻醉箱內(nèi)，觀察1 d，以神經(jīng)功能評分1～3分為造模成功[6]。以動物出現(xiàn)四肢緊張度降低、呼吸變慢，皮膚痛覺消失，角膜放射遲鈍，表示大鼠進入麻醉期。對照組大鼠僅予1%氯化鈉肌肉注射。各組大鼠均干預(yù)4 d。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定：準備直徑150 cm、高50 cm的圓形水池(水溫25℃)，并在其內(nèi)標注4個點位，水池中央放入直徑10 cm、高30 cm的平臺。3組大鼠各取5只置于4點位處，統(tǒng)計各組大鼠自入水點游至預(yù)置平臺時間，于120 s內(nèi)未游至平臺的大鼠引至平臺之上，將潛伏期記為120 s，大鼠在平臺上停留30 s之后，再將其放置其他不同入水點重新進行測試。所有大鼠均連續(xù)測試4 d，在第5 d時將大鼠從入水點放至水中，記錄60 s以內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)；對以上大鼠所需要時間進行統(tǒng)計、匯總。

1.3.2 血清炎性因子檢測：大鼠干預(yù)4 d后取尾部靜脈血3 ml，離心提取上清液，置于-40℃環(huán)境下保存待用。根據(jù)提取的血清樣品呈現(xiàn)出的不同散射光度檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1 β，IL-1β)水平，在光探測器90°的單色光源中對樣品加入凝血激活劑，隨著樣品凝塊的發(fā)生，其散射光強度會隨之增加，當(dāng)血清樣本完全凝固之后，其光照探測儀會隨之發(fā)生改變，隨后將血清樣本放置檢測器上進行處理并描繪出凝固曲線，按照凝固曲線對TNF-α、IL-1β水平進行評價。

1.3.3 腦組織病理及PI3K、Akt蛋白檢測：大鼠斷頭取腦組織，置于15%甲醇固定后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚3 μm，進行HE染色；PBS緩沖液沖洗標本后，行30 min裂解，測定蛋白濃度。選擇20 μg /孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后行電泳10 min，后將電轉(zhuǎn)膜浸于10%牛奶中，常溫環(huán)境下封存90 min。結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出以TBST液沖洗，結(jié)合二抗，保存60 min后清洗、顯色，使用Western-blot法檢測PI3K、Akt表達。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 對照組、2%丙泊酚組、4%丙泊酚組大鼠干預(yù)后第1～4 d水中逃避潛伏期隨時間均依次減少(F/P=20.070/0.001，28.440/0.001，18.720/0.001)，且4%丙泊酚組>2%丙泊酚組>對照組(P均<0.01)；穿越平臺次數(shù)比較，4%丙泊酚組<2%丙泊酚組<對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2 3組大鼠腦組織病理變化比較 對照組大鼠腦組織黑色顆粒均勻分布，清晰可見，分界明顯，神經(jīng)細胞未見異常變化；2%丙泊酚組大鼠神經(jīng)組織腔隙增大，排列疏松，細胞核內(nèi)藍染減少；4%丙泊酚組大鼠腦組織黑色顆粒分布過密，神經(jīng)組織明顯空隙,見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織病理變化比較(HE染色，×200)

2.3 3組大鼠血清炎性因子比較 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較，4%丙泊酚組>2%丙泊酚組>對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 3組大鼠血清炎性因子比較

2.4 3組大鼠腦組織PI3K、Akt表達比較 腦組織P-PI3K、P-Akt蛋白表達比較，4%丙泊酚組<2%丙泊酚組<對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖2。

表3 3組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達比較

圖2 3組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白印跡圖比較

3 討 論

丙泊酚作為一種新型的靜脈麻醉藥，因其起效快、蘇醒迅速、不良反應(yīng)少、持續(xù)靜脈滴注后無蓄積作用等特點，己廣泛應(yīng)用于臨床各科的手術(shù)麻醉[7]。有研究表明，丙泊酚麻醉對急性重型顱腦損傷及腦缺血再灌注患者中具有安全、可靠的麻醉效果。丙泊酚還具有吸收迅速及持續(xù)輸注后不易儲積、蘇醒完全等特點[8-10]。但有學(xué)者認為，使用丙泊酚麻醉可能會導(dǎo)致長時期行為改變，學(xué)習(xí)、記憶等功能出現(xiàn)異常，造成中樞神經(jīng)損傷，導(dǎo)致腦損傷的出現(xiàn)[11]。

TNF-α是腦創(chuàng)傷后較早釋放的重要促炎細胞因子，在腦組織中高度表達具有神經(jīng)毒性，可加速神經(jīng)細胞的死亡[12-13]。IL-1β可通過激活膠質(zhì)細胞，使其釋放細胞因子、自由基等參與腦內(nèi)炎性反應(yīng)。IL-1β過量表達可能通過多種途徑在腦損傷中介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡、缺失，引起繼發(fā)性腦損害[14-15]。有臨床研究顯示[16]，丙泊酚麻醉能夠?qū)е麓笫笱仔砸蜃赢惓?，出現(xiàn)TNF-α、IL-1β表達上升，由此可見，使用丙泊酚能夠改變大鼠TNF-α、IL-1β表達，增加大鼠海馬區(qū)的細胞凋亡率，最后導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)腦損傷。本結(jié)果顯示，丙泊酚麻醉大鼠穿越平臺次數(shù)降低，各時間點逃避潛伏期較長，并受丙泊酚濃度升高影響，高濃度丙泊酚麻醉大鼠各時間點逃避潛伏期更長，穿越平臺次數(shù)更低，由此得出，丙泊酚麻醉能夠?qū)Υ笫笊窠?jīng)元造成損傷，激發(fā)炎性因子釋放導(dǎo)致患者認知功能及學(xué)習(xí)功能下降。

PI3K/Akt信號通路是一種促神經(jīng)細胞生存的信號通路，mTOR也是該通路主要的下游效應(yīng)因子之一[17]。PI3K是脂質(zhì)激酶家族一員，通過磷酸化質(zhì)膜磷脂酰肌醇上的3-羥基來激活，但PI3K可以直接被細胞表面受體激活[18]。Akt是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，在細胞存活和凋亡中起重要作用。PI3K/Akt對腦損傷研究較少，其作用有待進一步證實[19]。有研究表明，激活PI3K/Akt通路能抑制炎性反應(yīng)和神經(jīng)細胞凋亡，減輕大鼠腦損傷面積，改善大鼠腦組織病理形態(tài)及神經(jīng)癥狀[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚麻醉誘發(fā)腦損傷大鼠模型中PI3K、Akt表達均呈現(xiàn)出下降趨勢，通過抑制腦外傷后神經(jīng)細胞凋亡，阻斷PI3K/Akt信號通路抑制腦損傷惡化。由此可見，使用丙泊酚麻醉能夠激活PI3K/Akt通路且通過PI3K/Akt通路誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生腦損傷。

綜上所述，使用丙泊酚麻醉能夠通過PI3K/Akt通路激活炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致腦損傷的發(fā)生。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

向思曲：資料整理及統(tǒng)計分析，論文撰寫；朱賢林：提出研究思路及設(shè)計研究方案；楊敏：實施研究過程；葉剛、王在平：論文修改