沈素朋，梁 佳，劉 磊，郭 煒，郭艷麗，董稚明

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，我國食管癌主要以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)為主，由于缺少可靠的早期診斷標(biāo)志物和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶標(biāo)，中、晚期患者的5年生存率較低[1-2]。核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)是指長(zhǎng)度60～300個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA分子，具有復(fù)雜的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)snoRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系密切[4-6]。核仁小RNA 71B(SNORA71B)位于人類染色體20q11.23，其在ESCC中的表達(dá)及功能尚未見報(bào)道。本文檢測(cè)SNORA71B在人ESCC細(xì)胞系及組織中的表達(dá)，分析其與ESCC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為ESCC的靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年4月～2015年9月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院診治的ESCC手術(shù)患者75例，術(shù)前均未接受放、化療。另收集癌旁正常組織(3～5 cm)作對(duì)照。收集1份新鮮組織置于-80 ℃低溫冰箱保存，提取總RNA；1份組織制成蠟塊用于HE染色觀察組織形態(tài)。隨訪75例ESCC患者，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為65個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑食管癌細(xì)胞系TE1、TE13、Eca109、Kyse150由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室留存并傳代；Trizol購自SBS公司；胎牛血清購自PAN公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；Lipofectamine 2000購自Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTS試劑購自Promega公司；Transwell小室、Matrigel膠購自Corning公司。

1.3 總RNA提取以及qRT-PCR檢測(cè)SNORA71B基因的表達(dá)根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行。應(yīng)用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，用于檢測(cè)SNORA71B基因的表達(dá)，上游引物：5’-GAGAGGAAT CAATGAAAGCGCT-3’，下游引物：5’-GCATGTAC GAAAGCTCCAGAGTT-3’，片段大小為81 bp，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min后；95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，SNORA71B基因以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為Ct值，采用相對(duì)定量法，以N=2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其數(shù)值表示癌組織相對(duì)于配對(duì)癌旁正常組織的相對(duì)倍數(shù)。

1.4 特異性shRNA的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染2條shRNA-SNORA71B由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成，分別命名為sh1-SNORA71B和sh2-SNORA71B另附送sh-NC(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組)作為對(duì)照。細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞均勻鋪于6孔板內(nèi)，細(xì)胞一般長(zhǎng)至70%開始轉(zhuǎn)染，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將4條shRNA-SNORA71B及sh-NC轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞Eca109中，6 h后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，并用熒光倒置顯微鏡觀察各組的轉(zhuǎn)染效率，提取各組細(xì)胞總RNA，用于觀察轉(zhuǎn)染4條shRNA-SNORA71B后mRNA的表達(dá)水平，選取干擾效率最高的shRNA-SNORA71B進(jìn)行后續(xù)功能試驗(yàn)。

1.5 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNORA71B表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用胰酶消化懸浮于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基含有1 000個(gè)細(xì)胞。分別在細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96 h每孔中加入MTS試劑20 μL(500 μg/mL)，孵育4 h后酶標(biāo)儀測(cè)定492 mm處的吸光度值。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNORA71B表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響將Matrigel膠稀釋后，向小室上層加入50 μL稀釋的Matrigel膠，37 ℃過夜。細(xì)胞首先使用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，每孔上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS沖洗3次。染色固定，將小室上的聚碳酸酯膜輕輕剪下，放于載玻片上，樹脂封固。顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，比較各組穿膜細(xì)胞數(shù)判斷細(xì)胞的侵襲性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及食管癌細(xì)胞中SNORA71B基因的表達(dá)首先應(yīng)用SNORic(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/SNORic)在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站分析SNORA71B在食管癌中的表達(dá)及其對(duì)患者生存期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNORA71B在癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織(圖1A)，SNORA71B高表達(dá)組患者的5年生存率低于低表達(dá)組(圖1B)。

本組檢測(cè)SNORA71B基因在75例ESCC組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示SNORA71B基因在ESCC組織中的相對(duì)表達(dá)量(3.242±1.074)明顯高于癌旁正常組織(1.212±0.470)(P<0.01，圖1C)。結(jié)合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)SNORA71B基因表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)深度和TNM分期相關(guān)(P<0.05，表1)。

圖1 不同食管組織中SNORA71B基因的表達(dá)：A.SNORic網(wǎng)站預(yù)測(cè)SNORA71B基因在食管癌及正常黏膜中的表達(dá)；B.SNORic網(wǎng)站預(yù)測(cè)SNORA71B表達(dá)對(duì)食管癌患者生存期的影響；C.75例食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中SNORA71B基因的相對(duì)表達(dá)量， **P<0.01

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌中SNORA71B的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 SNORA71B基因與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系根據(jù)SNORA71B在ESCC組織中表達(dá)的均值將患者分為SNORA71B高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組36例，低表達(dá)組39例。SNORA71B高表達(dá)組患者的5年生存率為12.3%(中位生存時(shí)間23個(gè)月)，低表達(dá)組患者的5年生存率為25.7%(中位生存時(shí)間35個(gè)月)。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)分析顯示，SNORA71B高表達(dá)可縮短ESCC患者的生存期(P<0.01，圖2)；為排除混雜因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，SNORA71B基因表達(dá)可能是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素(表2)。

圖2 SNORA71B表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

表2 多因素Cox回歸分析食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

2.3 食管癌細(xì)胞株中SNORA71B的表達(dá)及對(duì)Eca109細(xì)胞增殖及侵襲的影響應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SNORA71B基因在4株食管癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量(Eca109：2.36±0.21、Kyse150：1.67±0.21、Kyse170：1.46±0.19、TE1：1.36±0.10)高于對(duì)照組(1.04±0.08)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A)，在Eca109細(xì)胞中表達(dá)最高。

本組在SNORA71B表達(dá)最高的Eca109細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染2個(gè)針對(duì)SNORA71B設(shè)計(jì)的shRNA；應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)SNORA71B的敲低效率(sh1：0.41±0.04，sh2：0.65±0.04)。其中，sh1-SNORA71B的敲低效率最高，選其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(P<0.01，圖3B)。

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h后sh1-SNORA71B組與對(duì)照組相比，其能夠顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48 h：0.414±0.043vs0.319±0.037、72 h：0.540±0.057vs0.377±0.043、96 h：0.759±0.057vs0.537±0.059，P<0.05，圖3C)。上述結(jié)果提示敲低SNORA71B基因，可以抑制食管癌細(xì)胞系Eca109的體外增殖能力。

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)比較，sh1-SNORA71B組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(268.33±20.82vs223.00±6.08，P<0.05，圖3D)，提示敲低SNORA71B基因后可以抑制食管癌細(xì)胞系Eca109的體外侵襲能力。

圖3 SNORA71B在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)Eca109細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響：A.SNORA71B在4種食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平；B.qRT-PCR法檢測(cè)Eca109細(xì)胞中sh-RNAs的沉默效果；C.MTS檢測(cè)SNORA71B對(duì)Eca109細(xì)胞增殖能力的影響；D.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNORA71B對(duì)Eca109細(xì)胞侵襲能力的影響；pools.按等比例隨機(jī)混合10例食管正常黏膜組織的cDNA；sh-NC.轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組；*P<0.05，**P<0.01

3 討論

snoRNA是一類廣泛分布于真核生物細(xì)胞核仁的小分子非編碼RNA，最初發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)rRNA的假尿苷中起作用[7]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的snoRNA被發(fā)現(xiàn)、鑒定，越來越多的結(jié)果顯示snoRNA表達(dá)失調(diào)與各種惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生相關(guān)[8-10]，其在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌或致癌的作用。如SNORD126基因在肝細(xì)胞癌中起致癌作用，SNORD126過表達(dá)增加AKT、GSK-3β和p70S6K的磷酸化水平，并提高成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2)的表達(dá)[11]。SNORD89通過調(diào)節(jié)Notch1-c-Myc途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性并在卵巢癌發(fā)生中充當(dāng)癌基因，從而使卵巢癌患者預(yù)后不良[12]。

SNORA71B是由SNHG17的內(nèi)含子剪接而來，主要在細(xì)胞核中表達(dá)，位于染色體20q11.23，其在多種惡性腫瘤中有基因拷貝數(shù)的異常擴(kuò)增[13-15]。2017年Schulten等[16]通過分子探針技術(shù)鑒定SNORA71B在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中過表達(dá)。2020年Duan等[17]研究發(fā)現(xiàn)SNORA71B在腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌中高表達(dá)，且其高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，同時(shí)SNORA71B可通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞跨過血腦屏障進(jìn)行轉(zhuǎn)移。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG17通過正反饋回路調(diào)節(jié)其同源物SNORA71B表達(dá)上調(diào)，從而加重前列腺癌的進(jìn)展。以上結(jié)果提示SNORA71B可能參與惡性腫瘤的進(jìn)程。本組分析在線網(wǎng)站SNORic中SNORA71B在食管癌的表達(dá)及與其預(yù)后關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNORA71B在ESCC組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，生存分析發(fā)現(xiàn)SNORA71B高表達(dá)組患者的5年生存率顯著低于其低表達(dá)組。本組檢測(cè)75例ESCC及癌旁正常組織中SNORA71B的表達(dá)，分析SNORA71B表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示SNORA71B基因在ESCC組織中表達(dá)高于癌旁正常組織，SNORA71B表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)深度及TNM分期相關(guān)。

本組結(jié)果顯示，SNORA71B高表達(dá)明顯縮短ESCC患者的生存期，與不良預(yù)后密切相關(guān)。采用多因素Cox回歸模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SNORA71B高表達(dá)可作為ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。本組通過RNA干擾技術(shù)將sh-SNORA71B成功轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞Eca109中，結(jié)果顯示SNORA71B基因敲低后可抑制Eca109細(xì)胞增殖能力及侵襲能力。以上結(jié)果均提示SNORA71B基因在ESCC中可能發(fā)揮促癌作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SNORA71B基因在ESCC組織中表達(dá)升高，其高表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)。特異性的敲低SNORA71B基因表達(dá)，可抑制食管癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，提示SNORA71B基因可能在ESCC中發(fā)揮促癌作用，同時(shí)在ESCC惡性進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，有望成為ESCC生物學(xué)標(biāo)志物。