李露露，宋圓英，胡馨予，盧云

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,四川 成都 610075)

腦梗死(Cerebral Infarction，CI)又稱缺血性腦卒中，是因腦部血液循環(huán)障礙導致腦組織局限性缺血、缺氧壞死，使機體出現(xiàn)偏癱、失語、認知功能障礙等神經(jīng)功能缺損癥狀，具有病死率、致殘率、復發(fā)率高的特點，是危害人類健康的重大疾病之一[1]。世界衛(wèi)生組織2015年發(fā)布的全球非傳染性疾病狀況報告中指出，每年約1 750萬人死于非傳染性疾病，其中約670萬人死于中風[2]。目前西醫(yī)對該病的治療以對癥治療為主，包括降壓、降脂、抗凝、抗血小板聚集、抗炎和營養(yǎng)支持等，但部分患者治療效果不佳。近年來，隨著對中醫(yī)藥研究的不斷深入，中西醫(yī)結(jié)合治療方式在改善腦梗死患者神經(jīng)功能，減輕其臨床癥狀等方面發(fā)揮了重要作用[3]。

中醫(yī)認為CI屬于“中風病”范疇，以元氣虧虛為本，虛、瘀、痰、火、風夾雜，最終導致機體陰陽失調(diào)、氣血逆亂[4]。中醫(yī)藥在CI治療中發(fā)揮著重要作用[5]，藥對作為方劑組成核心部分是復方藥理研究的重要內(nèi)容，惠小珊等[4]在對腦梗死中藥復方專利用藥配伍規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，丹參-川芎是其中最常用的藥對。丹參味苦，性微寒，功能活血止痛、祛瘀生新、除煩安神；川芎味辛，性溫，功能活血行氣、祛風止痛[6]?，F(xiàn)代藥理學研究表明丹參提取物可透過血腦屏障，發(fā)揮抗凋亡、促進神經(jīng)血管再生等作用[7]；川芎提取物可能通過抑制NF-κB信號通路的激活發(fā)揮對腦缺血損傷的保護作用[8]。該藥對發(fā)揮治療效果的具體作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接機制研究丹參-川芎藥對治療腦梗死的關(guān)鍵靶點和作用機制，為日后的進一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選丹參-川芎藥對有效成分及其作用靶點

分別以“丹參”“川芎”為搜索詞在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中進行檢索，設(shè)置生物口服利用度(OB)≥30%、化合物類藥性(DL)≥0.18為閾值，得到丹參、川芎有效成分。在Related Targets列表下獲取整理有效成分作用靶點，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將得到的靶點名進行標準化轉(zhuǎn)換，獲取其簡稱。

1.2 篩選獲取疾病相關(guān)靶點

以“cerebral infarction”為檢索詞，在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，去除重復項獲得與腦梗死相關(guān)的靶點。

1.3 獲取藥物和疾病共同靶點并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

繪制韋恩圖得到藥物和疾病共同作用靶點，使用cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。在String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中導入二者共有的靶蛋白，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，其中“Homo sapiens”為蛋白種屬、“medium confidence>0.4”為相互作用閾值。

1.4 關(guān)鍵靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析

將關(guān)鍵靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體(GO)生物學功能過程分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，設(shè)置P<0.5為閾值，可視化處理后分析丹參-川芎藥對治療腦梗死可能涉及的分子功能和信號通路。

1.5 分子對接

利用AutoDock Vina軟件對丹參-川芎藥對三個主要成分MOL000006(Luteolin,木犀草素)、MOL007154(Tanshinone iia,丹參酮ⅡA)、MOL007088(Cryptotanshinon，隱丹參酮)和核心靶點EGFR、MYC、VEGFA進行分子對接實驗，從而驗證其相互間的作用活性。首先在TCMSP軟件上下載主要化合物的結(jié)構(gòu)文件，從PDB網(wǎng)站(http://www.rcsb.org/)下載核心靶點蛋白的pdb文件，利用AutoDock Tools對上述配體和受體進行常規(guī)處理，利用Autogrid得到對接活性位點，用AutoDock Vina進行分子對接，得到結(jié)合能(Affinity)。查閱大量文獻，以結(jié)合能≤-5 kJ/mol為分子與靶點結(jié)核性較好的篩選標準，結(jié)合能越小對接越好[9-11]。

2 結(jié)果

2.1 丹參-川芎藥對有效成分及其作用靶點

設(shè)置閾值OB≥30%，DL≥0.18后，共篩選出丹參-川芎藥對有效成分72種，其中丹參65種，川芎7種，具體內(nèi)容見表1。

表1 丹參-川芎藥對有效成分

2.2 藥物有效成分和疾病共同靶點預測結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺篩選獲取藥物有效成分靶點61個，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫共獲取疾病相關(guān)靶點3 110個，將藥物有效成分靶點和疾病靶點進行交集分析，得到共同作用靶點47個，具體內(nèi)容見表2。利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)(圖1)，共包含105個節(jié)點和397條邊。利用中心度值(Betweenness Centrality)和等級值(Degree)進行排序，得到排名靠前的化合物分別為MOL000006(luteolin,木犀草素)、MOL007154(tanshinone iia,丹參酮ⅡA)、MOL007088(cryptotanshinone,隱丹參酮)、MOL007049(4-methylenemiltirone，4-亞甲丹參新酮)和MOL007100(dihydrotanshinlactone,二氫丹參內(nèi)酯)。通過string數(shù)據(jù)庫對共有靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置相互作用閾值為中等(medium confidence>0.4)，得到47個節(jié)點和311條互作邊(圖2)。使用R軟件繪制Barplot條形圖進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)排名靠前的作用靶點是EGFR、MYC、VEGFA、GASP3、IL6等(見圖3，其中左列為基因名，如EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生長因子受體；數(shù)字為相應基因臨近節(jié)點數(shù)目，如EGFR相應節(jié)點數(shù)目為29)。

圖3 丹參-川芎藥對治療腦梗死互作關(guān)系barplot圖

表2 丹參-川芎藥對和腦梗死47個共同作用靶點

圖1 丹參-川芎藥對有效成分-疾病靶點圖

圖2 丹參-川芎藥對潛在靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO和KEGG富集分析結(jié)果

將關(guān)鍵靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫(P<0.05)，進行GO功能富集分析，得到生物過程(Biological Process，BP)條目426個，細胞組成(Cell Composition，CC)條目45個，分子功能(Molecular Function，MF)條目52個。按P值排序?qū)⑶?0條繪圖表示，其中點越大表示富集基因數(shù)越多，顏色越紅表示藥物對疾病的干預越密切，主要涉及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異類固醇正調(diào)控、核受體活性、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性等分子功能和生物過程(圖4)。對關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，得到31條信號通路，按P值排序?qū)⑶?0條繪圖表示，主要涉及PI3K-AKT、TNF、AGE-RAGE以及癌癥等通路(圖5)。

圖4 GO功能分析氣泡圖(前20)

圖5 KEGG通路分析氣泡圖(前20)

2.4 分子對接結(jié)果

使用AutoDock Vina軟件對丹參-川芎藥對中排名前三的活性成分和關(guān)鍵靶點EGFRA、MYC、VEGF進行分子對接。結(jié)合能小于0表明藥物分子和靶點能夠發(fā)生結(jié)合，結(jié)合能小于≤-5 kJ/mol表明分子與靶點結(jié)合性較好，結(jié)合能越小則對接越好[9-11]。對接結(jié)果表明藥物主要有效成分luteolin(木犀草素)、tanshinone iia(丹參酮ⅡA)、cryptotanshinone(隱丹參酮)與核心靶點EGFR、MYC、VEGF之間結(jié)合性較好，具體對接結(jié)果見表3。圖6～8為對接最好的組合，包括luteolin和MYC、tanshinone iia和VEGFA、4-methylenemiltirone和VEGFA。其中l(wèi)uteolin與MYC活性位點TYR-295、GLU-321、ASN-332、THR-337形成氫鍵作用，tanshinone iia與VEGFA活性位點ASP-276、LYS-286形成氫鍵作用，cryptotanshinone與EGFR活性位點VAL-34、TYR-36、CYS-32形成氫鍵作用，這些氫鍵是促進結(jié)合到活性位點的主要作用力[12]。

圖6 MYC和luteolin

表3 核心蛋白與化合物對接結(jié)果

3 討論

腦梗死在腦血管病中占據(jù)重要組成部分，丹參、川芎作為活血行氣、祛瘀生新的常用中藥，在腦梗死的治療中被廣泛運用。丹參的水溶性提取物丹參多酚酸、復方制劑丹參川芎嗪等更是在腦梗死治療中效果顯著。目前，大量研究顯示丹參-川芎藥對能夠改善腦組織缺血、抗炎、抗細胞凋亡、促進血管神經(jīng)再生，在改善患者預后方面發(fā)揮著顯著作用[13-16]。

本次研究中藥物有效成分和疾病靶點網(wǎng)絡(luò)顯示，丹參-川芎藥對的主要成分木犀草素(luteolin)、丹參酮ⅡA (tanshinone iia)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、4-亞甲丹參新酮(4-methylenemiltirone)和二氫丹參內(nèi)酯(dihydrotanshinlactone)是網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，提示這些化合物在丹參-川芎藥對中發(fā)揮治療腦梗死的重要作用。

研究表明，木犀草素作為一種天然存在的四羥基黃酮化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、保護血腦屏障通透性等作用[17-19]。其抗炎機制可能是通過抑制NF-κB信號通路激活從而降低促炎介質(zhì)一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生發(fā)揮作用[20-21]，最近的研究還發(fā)現(xiàn)木犀草素通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)激活PI3K/Akt信號通路，下調(diào)細胞凋亡，提高細胞存活率，并減少梗死體積[22]。丹參酮ⅡA是丹參中發(fā)現(xiàn)的一種親脂性化學物質(zhì)，既往的研究證實其對局灶性腦缺血和局灶性腦缺血/再灌注損傷具有保護作用，能夠擴張腦血管、改善微循環(huán)、減少梗死灶面積，從而實現(xiàn)改善腦梗死導致的腦功能代謝障礙[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠上調(diào)梗死區(qū)Bal-2蛋白水平并下調(diào)Bax蛋白水平，發(fā)揮抗凋亡作用，并且能抑制梗死區(qū)海馬和皮質(zhì)中IL-6、TNF-α、CRP水平以減輕炎癥反應[26]。目前常用的丹參酮ⅡA磺酸鈉(STS)能夠減弱自噬相關(guān)蛋白LC3-11、Beclin-1和Sirt的上調(diào)水平，從而發(fā)揮減輕神經(jīng)炎癥、改善神經(jīng)功能缺損的保護作用[27]。隱丹參酮是丹參中的脂溶性提取物，可透過血腦屏障干預β淀粉樣蛋白所形成的腦損害，還能夠通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡細胞信號途徑發(fā)揮對神經(jīng)細胞的保護作用，并且其提高線粒體膜電位、抑制細胞毒性的功能實現(xiàn)和PI3K-Akt信號通路密切相關(guān)[28]。在對缺血/再灌注大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可降低損傷大鼠神經(jīng)功能缺損行為學評分，減少腦梗死體積，通過抑制Caspase-3、miR-210表達上調(diào)來實現(xiàn)抗細胞凋亡、減少超氧化物產(chǎn)生的功能[29]。以上結(jié)果說明丹參-川芎藥對的主要成分可以通過多種途徑相互協(xié)同在腦梗死的治療中發(fā)揮作用，目前關(guān)于4-亞甲丹參新酮在治療腦梗死的研究中還很少得到報道，值得未來研究對其進行關(guān)注。

通過匹配藥物靶點和疾病靶點并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)得出丹參-川芎藥對治療腦梗死相關(guān)靶點47個，進一步分析發(fā)現(xiàn)EGFR、MYC、VEGFA、GASP3、IL6這五個靶點在治療網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位，表明其可能是丹參-川芎藥對治療腦梗死的重要靶點。表皮生長因子受體(EGFR)基因和細胞增殖、代謝密切相關(guān)，當表皮生長因子(EGF)與其結(jié)合時，EGFR被激活參與MAPK家族和PI3K/Akt信號通路傳導，影響細胞存活循環(huán)周期，從而在腦梗死后的神經(jīng)保護中發(fā)揮重要作用[30-31]。研究顯示促進腦梗死后神經(jīng)發(fā)生可以改善神經(jīng)功能預后，減輕病情，而EGFR在調(diào)控腦梗死后室管膜下區(qū)(SVZ)的神經(jīng)干細胞(NSCs)增殖和分化、促進神經(jīng)發(fā)生過程中至關(guān)重要[32],但其具體機制尚不明確。MYC基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組類癌基因，包括C-myc、N-myc、L-myc，其中N-myc下游調(diào)控基因(NDRG)家族成員在應激反應、細胞增殖、腫瘤基因調(diào)控中扮演重要角色[33]，其家族成員NDRG1可能通過Raf-ERK通路促進缺氧細胞生長，延長其應對缺氧的時長，從而發(fā)揮對神經(jīng)細胞的保護作用[34]。NDRG2在星形膠質(zhì)細胞中廣泛表達，參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)，具有穩(wěn)定血腦屏障、傳遞神經(jīng)突觸間信息、調(diào)節(jié)腦血流量等重要生理功能[35]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)作為眾所周知的缺氧誘導因子(HIF)靶基因，是促進血管新生的一個重要調(diào)節(jié)基因[36]。通過與其受體VEGFR2結(jié)合，能夠經(jīng)Ras/MAPK途徑傳導，刺激細胞內(nèi)皮增殖、遷移并維持細胞活性[37]。研究表明，在短暫性大腦中動脈閉塞的急、慢性期，VEGFA能通過上調(diào)腦缺血再灌注損傷后缺血區(qū)血管性血友病因子水平，促進血液循環(huán)從而改善腦梗死后的神經(jīng)功能缺損癥狀[38]。本研究顯示丹參-川芎藥對治療腦梗死的關(guān)鍵治療靶點集中在對血管生成的調(diào)控作用上，提示其治療作用和促進腦組織血管生成、改善缺血區(qū)血流供應密切相關(guān)。值得注意的是，研究還顯示治療靶點和癌癥關(guān)系密切，癌癥在中醫(yī)屬癥瘕積聚的范疇，腦梗死本質(zhì)上屬氣虛血瘀致有形之塊聚集，和癌癥有共通之處，中醫(yī)“異病同治”的思想得以體現(xiàn)。

圖7 VEGFA和tanshinone iia

圖8 EGFR和cryptotanshinone

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，丹參-川芎藥對治療腦梗死主要涉及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異類固醇正調(diào)控、核受體活性、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性等分子功能和生物過程，這些生物學過程在藥物治療腦梗死的機制通路中都有所體現(xiàn)。關(guān)鍵靶點主要富集于PI3K-AKT信號通路[21]、TNF信號通路[39]以及一些癌癥通路等。其中病毒感染的通路涉及Caspase-3 和 NF-κB，可對細胞凋亡、炎癥反應起調(diào)節(jié)作用[9,40]；PI3K-AKT信號通路富集效果明顯，提示其可能是丹參-川芎藥對治療腦梗死的核心通路，值得重點進行研究。先前各實驗研究中發(fā)現(xiàn)川芎具有較強的擴血管、改善循環(huán)、減輕神經(jīng)元損傷的作用[41]，周蕙芬等[42]在丹參-川芎藥對的實驗研究中發(fā)現(xiàn)其能夠抑制炎癥級聯(lián)反應，減少海馬神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的增加。以上研究結(jié)論和本次網(wǎng)絡(luò)藥理的結(jié)果具有一致性，表明此次研究結(jié)果較為可靠。GO和KEGG富集分析的結(jié)果表明丹參-川芎藥對的活性成分通過多種途徑發(fā)揮治療腦梗死的作用，這些通路和通路之間的協(xié)同關(guān)系都可以為以后的研究提供方向。分子對接結(jié)果顯示，丹參-川芎藥對的活性成分與MYC、EGFR、VEGFR的親和力較好，其化合物對疾病治療的有效性仍需進一步的實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對丹參-川芎藥對治療腦梗死的作用機制進行探究，認為其可能通過促進血管生成、抗細胞凋亡、抗炎等途徑改善梗死區(qū)神經(jīng)功能缺損情況，為了解丹參-川芎藥對治療腦梗死的機制提供了理論依據(jù)?？紤]到基于網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析的局限性以及藥物在煎煮過程中的互相作用，目前結(jié)果可為后續(xù)研究提供參考方向，但是具體的結(jié)果仍需進一步實驗驗證。