陳宇，武柳君，彭騰，熊秋韻，李夢婷，陳胡蘭，謝曉芳▲，彭成▲

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137;2.西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137)

黃精養(yǎng)生飲是以中藥黃精為原料制備的保健功能食品，由成都中醫(yī)藥大學黃精產(chǎn)業(yè)研究所研發(fā)，由黃精、山藥等制備而成。黃精具有補氣養(yǎng)陰、健脾、益腎等功效，主治脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、內(nèi)熱消渴等[1]。山藥具有補脾養(yǎng)胃、生津益肺、補腎澀精的功效，主治脾虛食少、久瀉不止、肺虛喘咳等[1]。黃精、山藥均是藥食兩用的補益類中藥[2]，應用歷史悠久，為傳統(tǒng)養(yǎng)生保健佳品。研究表明，黃精、山藥都含有大量多糖類成分[3-4]，多糖為大多補益類中藥的主要活性成分，其恢復和促進機體免疫功能的作用已得到了現(xiàn)代科學研究的廣泛證實[5-8]。由上推斷以黃精、山藥等為原料制成的黃精養(yǎng)生飲也可能具有調(diào)節(jié)免疫的功效。本研究采用正常小鼠和氫化可的松誘導的免疫低下模型小鼠進行試驗[9-10]，通過檢測特異性和非特異性免疫功能相關(guān)指標，評價黃精養(yǎng)生飲是否具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，為其進一步開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 實驗動物

KM小鼠，SPF級，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購于成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SYXK(川)2015-30；豚鼠，購于成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。實驗涉及動物的飼養(yǎng)和實驗過程中都遵守成都中醫(yī)藥大學實驗動物管理與保護的有關(guān)規(guī)定。

1.2 實驗藥物和試劑

黃精養(yǎng)生飲，1 g生藥/mL，由成都中醫(yī)藥大學黃精產(chǎn)業(yè)研究所彭騰研究員制備，用雙蒸水配制成實驗所需劑量，即5、2.5、1.25、0.625 g/kg；貞芪扶正膠囊(甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號：J20170208)，取12粒膠囊相當于原生藥25 g用雙蒸水配制成5 g/kg；氫化可的松(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1811231)，臨用前用生理鹽水配制成40 mg/kg備用；墨汁；雞紅細胞懸液(自制)。

1.3 儀器

全波長多功能酶標儀(VARIOSKAN FLASH 2.4.3，美國Thermo公司)；電子分析天平(AL104，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；高速冷凍離心機(Allegra X-30R，美國Beckman)。

2 實驗方法

2.1 正常小鼠碳粒廓清試驗[11-12]

取小鼠60只隨機分為6組：正常對照組(雙蒸水)、貞芪扶正膠囊組(5 g/kg)、黃精養(yǎng)生飲4個劑量組(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每組10只。首次給藥前禁食不禁水12 h，各組小鼠分別灌胃給予相應的藥物，稱重并灌胃給藥1次/d，連續(xù)給藥28 d。于末次給藥后禁食不禁水24 h，按0.1 mL/10 g尾靜脈注射生理鹽水稀釋4倍的墨汁(v/v)，于注射后第2 min(t1)、10 min(t2)分別用經(jīng)肝素鈉預處理的毛細管于眼后靜脈叢取血200 μL于盛有2 mL 0.1%碳酸鈉溶液的EP管中，吸入、吹出數(shù)次，混合均勻后吸取100 μL于96孔板內(nèi)，600 nm處測定并分別記錄吸光度值OD1、OD2。麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，解剖取脾臟、肝臟，稱重并計算臟器指數(shù)。按下列公式計算臟器指數(shù)和吞噬指數(shù)α。

臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%

K=(LogOD1-LogOD2)/(t2-t1)

α=體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×K1/3

2.2 氫化可的松致免疫功能低下試驗[13]

2.2.1 血清溶血素的測定[14]

2.2.1.1 雞紅細胞懸液和補體的制備

雞紅細胞懸液制備：無菌操作，自雞翼下靜脈取血，置于100 mL疫苗瓶中，加 5 倍量Alsever液，搖勻，4℃冰箱儲存。臨用時，用生理鹽水洗滌3次，前兩次232×g離心5 min，棄上清液和界面的白細胞層，后連續(xù)兩次412×g離心5 min，直至血細胞比容恒定，按此值用生理鹽水配成 5% 雞紅細胞懸液。補體制備：3只豚鼠股動脈抽血，取血清并混合，用生理鹽水稀釋成10%補體備用。

2.2.1.2 血清溶血素測定

取小鼠70只隨機分為七組：正常對照組、模型對照組、貞芪扶正膠囊組(5 g/kg)、黃精養(yǎng)生飲4個劑量組(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每組10只。首次給藥前禁食不禁水12 h，正常對照組和模型對照組給予雙蒸水灌胃，其于各組分別給予相應藥物，稱重并灌胃1次/d，連續(xù)給藥10 d。給藥前30 min，正常對照組皮下注射生理鹽水，其余各組均皮下注射氫化可的松40 mg/kg造模，2天一次，共5次。另給藥第3天，各組小鼠0.2 mL/只腹腔注射5%雞紅細胞懸液。末次給藥后禁食不禁水24 h，摘眼球取血0.5 mL后麻醉頸椎脫臼處死小鼠，取得的血1 860×g離心10 min，取血清20 μL，以0.9% NaCl稀釋血清100倍(v/v)，取稀釋血清1 mL與5%雞紅細胞懸液0.5 mL、10%補體0.5 mL混合，空白管用生理鹽水代替血清，37℃恒溫孵育30 min后，放于4℃冰箱終止反應；1 860×g離心10 min，取上清液300 μL于96孔板，540 nm處測定并分別記錄吸光度值。

2.2.2 遲發(fā)性變態(tài)反應[15]

取小鼠70只隨機分為七組：正常對照組、模型對照組、貞芪扶正膠囊組(5 g/kg)和黃精養(yǎng)生飲4個劑量組(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每組10只。首次給藥前禁食不禁水12 h，正常對照和模型對照組灌胃雙蒸水，其余各組分別灌胃給予相應藥物，稱重并灌胃1次/d，連續(xù)10 d。給藥前30 min，正常對照組皮下注射生理鹽水，其余各組均皮下注射氫化可的松40 mg/kg造模，2天一次，共5次。于給藥第4天，將50 μL 1%二硝基氯苯丙酮麻油溶液均勻涂于面積約為9 cm2的小鼠腹部(剃刀除毛)，第2天同劑量同部位再強化1次致敏。末次給藥30 min后于小鼠右耳兩面涂1%二硝基氯苯丙酮麻油溶液20 μL/只進行攻擊，攻擊24 h。麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，用直徑8 mm的打孔器于左右耳相同部位打下耳片，稱重，并以左右耳片的質(zhì)量差為腫脹度，比較各組小鼠的耳廓腫脹度。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 實驗結(jié)果

3.1 黃精養(yǎng)生飲對正常小鼠免疫功能的影響

由表1可知，給予黃精養(yǎng)生飲后，各劑量組小鼠在體質(zhì)量，肝臟、脾臟指數(shù)，吞噬指數(shù)α值上與正常對照組相比未見明顯差異。表明黃精養(yǎng)生飲對正常小鼠的免疫功能無明顯影響(見表1)。

表1 正常小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)、吞噬指數(shù)α

3.2 黃精養(yǎng)生飲對氫化可的松致小鼠免疫低下的影響

3.2.1 對血清溶血素的影響

與正常對照組相比，氫化可的松模型對照組小鼠血清溶血素水平降低(P<0.01)；與模型對照組相比，黃精養(yǎng)生飲各劑量組小鼠血清溶血素水平提高(P<0.01)，但在5 g/kg劑量下無統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2 免疫低下小鼠血清溶血素水平

3.2.2 對遲發(fā)性變態(tài)反應的影響

由表3可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠的耳廓腫脹度明顯降低(P<0.05)；與模型對照組相比，黃精養(yǎng)生飲各劑量組小鼠耳廓腫脹度均有回升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

表3 免疫低下小鼠耳廓腫脹度

4 討論

免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細胞、免疫活性物質(zhì)組成，包括中樞和外周免疫器官、淋巴細胞、單核吞噬細胞等[16]，發(fā)揮特異性免疫和非特異性免疫調(diào)節(jié)功能。免疫器官質(zhì)量可衡量免疫抑制狀態(tài)下機體免疫功能的強弱，其中胸腺、脾臟、肝臟是重要的免疫器官，是衡量免疫功能的重要指標[17]。單核巨噬細胞是非特異性免疫的重要組成部分，當細菌、異物等抗原性物質(zhì)進入機體后，可迅速被其吞噬和清除，其吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一[18-19]。實驗研究常用碳粒廓清法測定血液中碳粒的消失速度來反映單核巨噬細胞吞噬異物的能力[20]。本研究灌胃給予正常小鼠黃精養(yǎng)生飲，結(jié)果顯示在5 g/kg劑量下小鼠的體質(zhì)量、肝和脾的臟器指數(shù)及碳粒廓清吞噬指數(shù)有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義，表明其對正常狀態(tài)下的免疫系統(tǒng)沒有嚴重影響，不會引發(fā)正常狀態(tài)下機體免疫功能的異?？哼M。

特異性免疫包括體液免疫和細胞免疫，是機體免疫防御的重要組成部分。血清溶血素的含量反映了B淋巴細胞增值及分化為漿細胞后分泌溶血素的能力，常用于評價機體的體液免疫功能[21]。本研究中，氫化可的松誘導的免疫抑制模型小鼠血清溶血素水平降低，各劑量黃精養(yǎng)生飲均可使血清溶血素水平回升，表明黃精養(yǎng)生飲可增強免疫低下狀態(tài)下的體液免疫功能。遲發(fā)型變態(tài)反應常用于評價細胞免疫功能，采用致敏抗原激活T淋巴細胞形成活化T淋巴細胞，當活化T淋巴細胞再次與相應致敏抗原接觸，兩者發(fā)生特異性結(jié)合并釋放出多種細胞因子，導致局部組織發(fā)生以單核細胞浸潤和變性壞死為主要特征的炎癥反應[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，黃精養(yǎng)生飲在一定程度上能增加小鼠的耳腫脹度，反映其對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應具有一定的刺激作用，表明黃精養(yǎng)生飲可增強免疫低下小鼠細胞免疫功能。

本實驗初步探索了黃精養(yǎng)生飲對正常小鼠和免疫低下模型小鼠免疫功能的影響，結(jié)果顯示其對正常小鼠的免疫功能有一定程度的增強趨勢，但無統(tǒng)計學意義，而同劑量下可增強免疫低下小鼠的血清溶血素水平、提高T淋巴細胞活性，顯示出提升體液免疫和細胞免疫的功能。給藥期間，小鼠無其它不良反應或不適表現(xiàn)。研究表明，黃精養(yǎng)生飲作為一種增強免疫功能的功能飲品作用溫和有效且安全。