楊靈康 陳卓 郭盈希

摘要 在化學(xué)酶法合成肝素過程中，肝素修飾酶6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶（6-OST）在肝素分子中N-乙酰基葡糖胺的C6羥基上進(jìn)行硫酸化，以達(dá)到與肝素相似的硫酸化水平。構(gòu)建的重組蛋白MBP-6-OST-3的純化結(jié)果表明有較多雜蛋白條帶，且蛋白濃度較低。利用定點(diǎn)突變?cè)碓O(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增得到突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3），實(shí)現(xiàn)了MBP-6-OST-3-His蛋白的表達(dá)。利用鎳柱親和層析系統(tǒng)將MBP-6-OST-3-His蛋白純化，并通過SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。該研究獲得了具有高表達(dá)、高純度的MBP-6-OST-3-His蛋白，這為獲得高純度的6-OST-3提供了可靠的方法以及為其應(yīng)用于化學(xué)酶法合成肝素的研究提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 肝素;6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶;定點(diǎn)突變;大腸桿菌;蛋白表達(dá)

中圖分類號(hào) Q939.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）05-0081-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

High-yield Expression of Heparin-modifying Enzyme 6-O-sulfotransferase

YANG Ling-kang，CHEN Zhuo，GUO Ying-xi

（School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009）

Abstract In chemoenzymatic synthesis of heparin，the enzyme 6-O-sulfotransferase （6-OST） sulfated C6 hydroxyl of N-acetylglucosamine to achieve a sulfation level similar to that of heparin.The purification results of the constructed recombinant protein MBP-6-OST-3 showed contaminated protein bands，and the protein concentration was lower.In this paper，the principle of site-directed mutagenesis was used to design primers，and the mutant plasmid pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His was obtained by PCR amplification.The mutant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta-gamiB （DE3） to express MBP-6-OST-3-His protein.The MBP-6-OST-3-His protein was purified by a nickel column affinity chromatography system，and the protein expression was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis.In this study，the MBP-6-OST-3-His protein with high expression and high purity was obtained，which provided a reliable method for obtaining high-purity 6-OST-3 and a certain theoretical basis for its application in the study of chemical enzymatic synthesis of heparin.

Key words Heparin;6-O-sulfotransferase;Site-directed mutagenesis;Escherichia coli;Protein expression

作者簡介 楊靈康（1994—），男，安徽池州人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)。

收稿日期 2021-06-07

肝素是一種線性的、高度硫酸化的糖胺聚糖，由葡萄糖醛酸（主要是艾杜糖醛酸）以1→4糖苷鍵與葡萄糖胺重復(fù)二糖單元組成[1-2]。肝素通常是臨床上廣泛使用的凝血抑制劑[3]。肝素廣泛分布于動(dòng)物細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中。肝素原料藥可以從包括豬腸和牛肺在內(nèi)的哺乳動(dòng)物組織中提取，其中，豬的腸黏膜是肝素生產(chǎn)的最常用來源之一[4-5]。然而，動(dòng)物源肝素生產(chǎn)供應(yīng)鏈生產(chǎn)過程長，提取步驟多，易受污染。2008年的肝素鈉污染事件，導(dǎo)致100余名患者因注射了被污染的肝素而死亡，原因是由于肝素?fù)饺肓诉^度硫酸化的硫酸軟骨素[6]。因此，確保肝素安全來源是有意義的，需要建立安全可靠的肝素體外合成方法[7]。

目前，合成非動(dòng)物來源肝素具有代表性的一種方法是化學(xué)酶促法。利用肝素前體多糖作為合成肝素的起始碳骨架，在體外通過N-脫乙酰基酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶、C5-異構(gòu)化酶、2-O-磺基轉(zhuǎn)移酶（2-OST）、6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶（6-OST）和3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶（3-OST）催化，以3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）提供磺基，合成具有活性的肝素[8]。盡管化學(xué)酶法生產(chǎn)肝素具有廣闊的前景，但仍存在很多挑戰(zhàn)，其中包括幾種肝素修飾酶的制備[9]。

6-OST是化學(xué)酶法合成肝素的一種肝素修飾酶。6-OST將PAPS中的磺基轉(zhuǎn)移到氨基葡萄糖殘基的6-OH位置以形成6-O-磺基氨基葡萄糖，是化學(xué)酶法合成肝素過程中必不可少的步聚[10]。6-OST已成功在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。Chen等[11]將小鼠6-OST-3（Pro121-Pro450）的催化結(jié)構(gòu)域克隆到載體pMAL-c2X中，并在帶有質(zhì)粒pGro7的origami-B細(xì)胞中表達(dá)，該質(zhì)粒表達(dá)大腸桿菌的伴侶蛋白GroEL和GroES，但酶產(chǎn)量小于10 mg/L。因此，作為6種肝素生物合成酶之一，合成高產(chǎn)量的6-OST是用于化學(xué)酶法生產(chǎn)生物工程肝素的必要前提。

為獲得高純度的6-OST-3蛋白，該研究通過PCR擴(kuò)增得到帶有HIS-TAG的突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6OST-3-linker-His，并在大腸桿菌Rosseta-gami B細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)。通過鎳柱親和層析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化，獲得了高純度MBP-6-OST-3-His蛋白。該結(jié)果為獲得高純度的6-OST-3提供方法，并為后續(xù)將其應(yīng)用于化學(xué)酶法合成肝素等研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pMAL-c2X-6OST-3由合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物與酶工程實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌菌株DH5α、Rosetta-gamiB（DE3）購于Invitrogen公司;PrimeSTAR GxL DNA聚合酶購于TaKaRa公司;SanPrep柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒、柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒購于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化。根據(jù)定點(diǎn)突變?cè)恚紫仍O(shè)計(jì)1對(duì)引物，以pMAL-c2X-6OST-3為模版通過聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增帶有3個(gè)His密碼子的突變質(zhì)粒，上下游引物分別為5′-GGCAGCAGCCATCATCATAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGT-3′和5′-ATGATGATGGCTGCTGCCCATATGCTATGGTCCTTGTTGG-3′，再以突變后的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)另1對(duì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增另外3個(gè)His密碼子，上下游引物分別為5′-CATCATCACAGCAGCGGCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTA-3′和5′-GCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCC-3′。因此，經(jīng)2次PCR擴(kuò)增后可直接得到突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His，PCR反應(yīng)使用PrimeSTAR GxL DNA聚合酶，條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 13 min，共16個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸30 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，進(jìn)行切膠回收，隨后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用抗性平板（氨芐青霉素）篩選陽性克隆。

1.2.2 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His驗(yàn)證。對(duì)抗性平板篩選出的陽性克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證引物分別為5′-ATTCAACTTCACCCTCAAGGA-3′及5′-CCAGTGCCAAGCTTTTAGG-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 15s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶大小以進(jìn)行驗(yàn)證。選擇條帶大小符合的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，通過質(zhì)粒提取試劑盒將突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His提取并送樣至通用生物公司進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta-gamiB（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以用于后續(xù)蛋白誘導(dǎo)的表達(dá)。

1.2.3 MBP-6-OST-3-His蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。挑取大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）/pMAL-c2X-6OST-3-linker-His單克隆，加入至含有3 mL LB的培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日將菌液轉(zhuǎn)接于2 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h至生長對(duì)數(shù)期，使得OD 600值約為0.6。再向瓶中加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），并于22 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.4 MBP-6-OST-3-His蛋白純化。將2 L過夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行收集，并于高速離心機(jī)中以5 000 g轉(zhuǎn)速離心15 min，離心后收集細(xì)菌沉淀。用60 mL Buffer A（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，30 mmol/L Imidazole，pH 7.5）將菌體重懸，并加入終濃度為100 μmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）。充分混勻后，利用超聲波破碎菌體細(xì)胞（工作時(shí)間5 s，暫停時(shí)間5 s，功率50%，運(yùn)行時(shí)間30 min）。將細(xì)胞破碎液收集，于高速離心機(jī)中以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速，在4 ℃條件下離心20 min。離心后以收集上清，并通過0.45 μm濾膜過濾以去除雜質(zhì)。利用鎳親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。用10倍柱體積的Buffer A以1 mL/min的流速充分平衡鎳親和層析柱，將過濾后的粗蛋白溶液以同樣流速上樣后，用Buffer A（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，30 mmol/L Imidazole，pH 7.5）洗脫雜蛋白，用Buffer B（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L Imidazole，pH 7.5）洗脫目的蛋白，分管收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。收集濃度較高的蛋白洗脫液，用透析袋（[MWCO]為14 kD）在2 L透析液Buffer C（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 7.5）中進(jìn)行透析。將透析的蛋白6-OST-3收集于離心管，保存于-80 ℃。通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白，并利用Image J軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MBP-6-OST-3蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將小鼠6-OST-3（Pro121–Pro450）的催化結(jié)構(gòu)域克隆到載體pMAL-c2X中，并在帶有pGro7質(zhì)粒的origami-B（DE3）細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，該質(zhì)粒表達(dá)大腸桿菌的伴侶蛋白GroEL和GroES，結(jié)果見圖1。圖1中，泳道1為上樣蛋白，泳道2為洗雜時(shí)蛋白，泳道3為洗脫目的蛋白。從圖1可見，表達(dá)MBP-6-OST-3時(shí)，該蛋白雖然可溶性好，但蛋白洗脫后仍有較多雜條帶，且蛋白濃度低，純化后6-OST-3的產(chǎn)量僅為6.1 mg/L，蛋白的產(chǎn)量低。因此，需要對(duì)MBP-6OST-3進(jìn)行改造以提高蛋白濃度和純度。該研究擬在MBP-6OST-3質(zhì)粒中加入HIS-TAG，并使用鎳柱親和層析對(duì)該蛋白進(jìn)行純化，從而提高蛋白的產(chǎn)量及純化效率。

2.2 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His的構(gòu)建

為獲得高表達(dá)的6-OST，以質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3為模板，通過2次PCR擴(kuò)增后，可直接得到突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。如圖2A所示，由于在PCR擴(kuò)增中新產(chǎn)生的DNA鏈組成的突變質(zhì)粒有缺口，因而形成開環(huán)質(zhì)粒，電泳遷移速度較超螺旋質(zhì)粒更慢[12]。將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，開環(huán)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)缺口發(fā)生連接，重新恢復(fù)成超螺旋狀態(tài)。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖2B，泳道1為擴(kuò)增的質(zhì)粒，可以看到2條帶，分別為8 000 bp及3 000 bp附近，這是由于質(zhì)粒存在開環(huán)和超螺旋2種形態(tài)所致。將這2個(gè)片段分別進(jìn)行切膠回收及純化，并分別轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過氨芐青霉素（Ap）抗性平板篩選陽性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取，并將突變質(zhì)粒進(jìn)行送樣測(cè)序以進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His的驗(yàn)證

對(duì)構(gòu)建的突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。圖3A為菌落PCR驗(yàn)證，泳道1、2為DH5α/pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His菌落PCR驗(yàn)證的結(jié)果，DNA片段大小均符合理論值（990 bp）。隨后將這2個(gè)陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，并送樣測(cè)序。由圖3B可見，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果及測(cè)序波形圖，可以發(fā)現(xiàn)突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His序列中的CATCATCATCATCATCAC為HIS-TAG的堿基序列，可確認(rèn)測(cè)序質(zhì)粒為正確的突變質(zhì)粒。

2.4 MBP-6-OST-3-His表達(dá)與純化

將DNA測(cè)序結(jié)果顯示為正確的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）表達(dá)菌株中，用IPTG于22 ℃條件下誘導(dǎo)過夜。取500 μL誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后的菌液離心，用Buffer A重懸，通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。圖4A中泳道M為蛋白Marker，泳道1為誘導(dǎo)前的蛋白，泳道2為誘導(dǎo)后的蛋白。結(jié)果表明，泳道2在81 kD附近有較為明顯的蛋白條帶，這與MBP-6-OST-3-His的蛋白分子量大小一致。為了得到純化的蛋白MBP-6-OST-3-His，利用鎳柱親和層析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化，并將目的蛋白濃度較高的蛋白洗脫液進(jìn)行透析，收集在離心管中，保存于-80 ℃冰箱。對(duì)所得透析液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖4B，泳道M為蛋白Marker，泳道1為純化后的蛋白，只有1條帶，為目的蛋白MBP-6-OST-3-His，且純化效果較好。利用Image J軟件對(duì)純化后的目的蛋白MBP-6-OST-3-His進(jìn)行定量，MBP-6-OST-3-His蛋白濃度為153.8 mg/L，遠(yuǎn)高于MBP-6-OST-3純化后蛋白濃度。這說明MBP-6-OST-3質(zhì)粒加入HIS-TAG后，蛋白純化效率和產(chǎn)量得到了顯著提升。

3 結(jié)論

該研究為獲得高產(chǎn)量的6-OST-3蛋白，向MBP-6-OST-3質(zhì)粒中加入HIS-TAG，從而構(gòu)建突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）菌株中進(jìn)行蛋白表達(dá)。首先以pMAL-c2X-6OST-3質(zhì)粒為模板，經(jīng)2次PCR擴(kuò)增后得到突變質(zhì)粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。由于突變質(zhì)粒在擴(kuò)增后有缺口，從而呈現(xiàn)為開環(huán)質(zhì)粒狀態(tài)，區(qū)別于從細(xì)胞提取的非突變超螺旋質(zhì)粒。此外，通過PCR擴(kuò)增，將質(zhì)粒進(jìn)行突變，經(jīng)過切膠回收純化后可直接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，這比通過酶切酶連加入外源DNA的傳統(tǒng)方法更加迅速便捷。最后，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）菌株中進(jìn)行蛋白表達(dá)，經(jīng)過鎳柱純化可以得到高濃度、高純度的MBP-6-OST-3-His。該結(jié)果為獲得高純度的6-OST-3提供了可靠方法，以及為后續(xù)將其應(yīng)用于化學(xué)酶法合成肝素等研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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