劉博群，方蘭蘭

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖與遺傳?？漆t(yī)院，鄭州 450052)

生長分化因子8(GDF-8)在全身各個組織廣泛分布且發(fā)揮著重要作用，其參與調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育、脂類和蛋白質(zhì)代謝。自從2012年首次報道血清GDF-8水平與PCOS患者腹部肥胖呈正相關(guān)[1]，此后，越來越多的研究關(guān)注于GDF-8在女性生殖系統(tǒng)中的作用和機理。GDF-8參與調(diào)控女性生殖生理過程，如卵泡發(fā)育、排卵、卵巢類固醇激素合成、胚胎著床及胎盤發(fā)育，同時，還參與生殖相關(guān)疾病的發(fā)生，如多囊卵巢綜合征(PCOS)[2]、子宮肌瘤[3]、先兆子癇[4]。此外，GDF-8還參與不孕癥患者妊娠結(jié)局的調(diào)控。本文將從GDF-8對卵泡發(fā)育、排卵、胎盤功能調(diào)控、女性生殖疾病調(diào)控和輔助生殖技術(shù)應用中的作用等方面進行綜述，以期為女性生殖生理機制的深入研究以及相關(guān)疾病診療新策略的提出提供重要科學依據(jù)。

一、GDF-8的概況

1.GDF-8的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)：McPherron等[5]首次發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)家族的新成員GDF-8，GDF-8敲除小鼠的肌肉量大約是野生型小鼠的2倍，鑒于GDF-8作用是抑制骨骼肌生長和分化，因此又被稱為肌肉生長抑制素(Myostatin)。隨后，在牛、羊、狗等物種中也發(fā)現(xiàn)GDF-8缺陷促使肌肉量增加[6]。Schuelke等[7]在患有肌肉肥大的患兒中發(fā)現(xiàn)了GDF-8突變，說明GDF-8在人體中同樣具有抑制骨骼肌生長的作用。

GDF-8屬于TGF-β超家族成員，由位于人類2號染色體長臂32.2位的MSTN基因編碼。最初合成的GDF-8前體蛋白大小為52 kDa，其具有N端分泌信號、前肽結(jié)構(gòu)域和C端RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)蛋白水解位點，該前體蛋白需要經(jīng)過兩次蛋白水解才能形成有活性的GDF-8[8]。成熟的GDF-8分子量為25.0 kDa，為二聚體分泌型多肽，在人類、小鼠、大鼠、豬、雞、火雞和狗中具有高度同源性。

2.GDF-8的受體和信號通路：TGF-β家族受體包含高親和力的Ⅱ型受體和低親和力的Ⅰ型受體，兩種受體亞型具有相似的結(jié)構(gòu)和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。目前，已知有7種Ⅰ型受體，分別為激活素受體樣激酶1-7(ALK1-7)和5種Ⅱ型受體，分別為ACVR2A、ACVR2B、TβR2、BMPR2和AMHR2[9]。與GDF-8結(jié)合的Ⅰ型受體是ALK4和ALK5，與GDF-8結(jié)合的Ⅱ型受體是ACVR2A和ACVR2B[6]。

GDF-8可激活Smad依賴和Smad非依賴信號通路[8]。GDF-8與Ⅱ型受體結(jié)合激活Ⅰ型受體，磷酸化Smad2/3并與Smad4結(jié)合形成復合物調(diào)控核內(nèi)靶基因，抑制性Smad7可消除GDF-8信號。此外，GDF-8還可以激活ERK、p38 MAPK和JNK等Smad非依賴信號通路[8]。

3.GDF-8在生殖系統(tǒng)中的表達：GDF-8及其受體在人卵巢中均有表達，且在顆粒細胞中的含量最高[10]，卵泡液中也可以檢測到GDF-8[11]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8在人胎盤中的表達量隨孕周的增加而顯著下降[12]，在人子宮肌層和內(nèi)膜中也有GDF-8及其受體的表達[13-14]，而人輸卵管中是否有GDF-8表達尚未有報道。

二、GDF-8參與生殖生理活動調(diào)控

1.GDF-8參與顆粒細胞增生：結(jié)締組織生長因子(CTGF)在人卵泡顆粒細胞中高表達，是卵泡膜細胞招募、卵泡發(fā)育和黃體血管形成過程中的關(guān)鍵蛋白[15]。Chang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8和CTGF顯著抑制人黃素化顆粒細胞(HGL)的增殖，GDF-8通過ALK 4/5介導的Smad 2/3信號通路上調(diào)CTGF的表達，該促進作用與GDF-8濃度呈正相關(guān)，此外，靶向敲除CTGF可以逆轉(zhuǎn)GDF-8對HGL細胞的抑制作用，從而證實了GDF-8對HGL細胞增殖負性調(diào)節(jié)作用的機制。

2.GDF-8對卵巢類固醇激素生成的調(diào)控作用：Cheewasopit等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在牛顆粒細胞中GDF-8增加基礎(chǔ)芳香化酶(Aromatase)的表達和E2分泌，降低基礎(chǔ)和FSH誘導的3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)的表達和孕酮分泌；在卵泡膜細胞中，GDF-8抑制基礎(chǔ)和LH刺激的雄激素分泌，而不影響孕酮分泌。我們團隊之前研究發(fā)現(xiàn)，在HGL細胞中GDF-8通過ALK5介導Smad2/3信號通路上調(diào)Aromatase的表達并增加E2水平[18]，增加FSH受體水平來增強FSH的效應。同時，GDF-8通過ALK5介導的Smad3和ERK1/2信號通路，下調(diào)類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的表達并減少孕酮的產(chǎn)生。GDF-8通過減少LH受體水平來減弱LH的效應，且不影響細胞中P450側(cè)鏈切割酶和3β-HSD的表達。GDF-8通過抑制排卵前卵泡晚期孕酮的生成，在預防黃體過早形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這一重要的生理功能用于維持卵泡生長和體細胞增殖[19-20]。GDF-8對HGL細胞類固醇激素合成的調(diào)控過程見圖1。

圖1 GDF-8對HGL細胞類固醇激素合成的調(diào)控過程示意圖

3.GDF-8參與卵丘擴張：正五聚體蛋白(PTX3)是PTX家族的經(jīng)典蛋白，有聚合作用，參與形成穩(wěn)定的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)，有助于細胞外基質(zhì)組裝與卵丘擴張[21]。El-magd等[22]用腺相關(guān)病毒攜帶MSTN前肽(AAV-MSTNP)作為GDF-8抑制劑，發(fā)現(xiàn)在水牛卵母細胞體外成熟(IVM)中，AAV-MSTNP下調(diào)PTX3并抑制卵丘擴張。而我們研究證實，在人顆粒細胞中GDF-8通過ACVR2A/ACVR2B-ALK5介導的Smad信號通路下調(diào)PTX3的表達，抑制卵丘擴張，在排卵前減數(shù)分裂停滯后起著維持卵丘的作用[11]。

4.GDF-8與卵母細胞成熟：在豬卵母細胞IVM中，培養(yǎng)基補充GDF-8會激活P38 MAPK信號通路從而改變卵母細胞成熟相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，使細胞內(nèi)ROS水平下降，促進卵母細胞成熟[23]。之后研究者還發(fā)現(xiàn)，GDF-8也可以通過Smad2/3信號通路促進減數(shù)分裂和細胞質(zhì)成熟[24]。在水牛卵母細胞IVM中，通過觀察卵母細胞IVM效率和卵丘-卵母細胞復合體中特異性基因的表達情況發(fā)現(xiàn)，GDF-8抑制劑可顯著降低卵母細胞的成熟率，使達到減數(shù)分裂中期的卵母細胞減少，并伴隨著相關(guān)凋亡基因的表達上調(diào)，抗凋亡基因的表達下調(diào)[22]。在人卵巢中GDF-8可以促進顆粒細胞賴氨酸氧化酶(LOX)的表達及活性[25]，而LOX在卵泡發(fā)育過程中可以穩(wěn)定細胞外基質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)卵母細胞的標志物[26]，提示GDF-8參與促進卵母細胞成熟。

5.GDF-8參與調(diào)控胚胎發(fā)育：Yoon等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在豬胚胎體外培養(yǎng)中外源性GDF-8通過改變基因的轉(zhuǎn)錄模式，從而增強內(nèi)細胞團標記物SOX2的表達和內(nèi)細胞團/滋養(yǎng)外胚層比例以提高體外受精中的囊胚質(zhì)量。El-magd等[22]研究表明，GDF-8抑制劑作用于體外培養(yǎng)的水牛卵母細胞后，其受精效率、卵裂率和囊胚率顯著下降。此外，Wong等[28]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8可以促進金倉鼠體外培養(yǎng)的胚胎滋養(yǎng)層的增殖與孵化、抑制附著，其抑制附著是通過干擾胚胎著床蛋白酶表達或減弱子宮內(nèi)膜上皮細胞產(chǎn)生的白血病抑制因子發(fā)揮作用的。因此，GDF-8參與植入前胚胎發(fā)育過程，而GDF-8在人體胚胎調(diào)控中的作用尚無研究。

6.GDF-8參與調(diào)控胎盤功能：Peiris等[29]用不同濃度的GDF-8處理人原代絨毛膜滋養(yǎng)層細胞(EVT)及其細胞系(HTR-8/Svneo)發(fā)現(xiàn)，GDF-8促進EVT和HTR-8的增殖與遷移，EVT和HTR-8的增殖與GDF-8劑量相關(guān)，而遷徙無劑量依賴性。GDF-8在調(diào)控滋養(yǎng)層細胞侵襲中的作用尚有爭議。卵泡抑制素樣3(FSTL3)是GDF-8拮抗劑[30]，可顯著促進滋養(yǎng)層的侵襲和脂質(zhì)儲存，抑制滋養(yǎng)層的凋亡，而研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8通過ALK5-Smad2/3信號通路上調(diào)FSTL3的表達并促進滋養(yǎng)層細胞侵襲[31-32]。Mitchell等[12]通過體外放射標記脫氧葡萄糖評估胎盤組織葡萄糖攝取發(fā)現(xiàn)，GDF-8促進人胎盤組織的葡萄糖代謝，有助于胎盤葡萄糖穩(wěn)態(tài)，可能是治療胎盤功能不全、妊娠糖尿病等疾病的靶點。Antony等[33]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8抑制絨毛膜癌細胞系(BeWo細胞)的葡萄糖攝取。以上兩項研究結(jié)果的差異可能由于原代滋養(yǎng)細胞和細胞系在基因表達、甲基化模式和HLA分子表達方面存在差異。

三、GDF-8參與的女性生殖疾病

1.多囊卵巢綜合征(PCOS)：PCOS是不孕癥患者最常見的原因之一，其鹿特丹診斷標準[34]為稀發(fā)排卵或無排卵、臨床/生化高雄激素血癥、多囊卵巢的超聲表現(xiàn)，滿足兩個及以上者即可診斷。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵巢竇卵泡中GDF-8及其受體水平增加[10]，卵泡液中GDF-8水平較高[2]，而血清GDF-8水平無顯著變化[1，35]。有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵泡液GDF-8表達水平高于血清，說明其作為卵巢源性因子參與PCOS的發(fā)生[2]。Bai等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者中GDF-8通過ALK5介導的Smad2/3信號通路上調(diào)人纖溶酶原激活物抑制劑1(SERPINE1)的表達，從而對顆粒細胞造成葡萄糖代謝損傷，并使得PCOS患者代謝紊亂。

2.卵巢癌：在卵巢癌中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)下調(diào)參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，即上皮細胞失去粘附而獲得遷移和侵襲特性[37]。Zhao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8激活ALK4/5-Smad2/3信號通路下調(diào)E-cadherin的表達，上調(diào)EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達，參與卵巢癌細胞的擴散轉(zhuǎn)移。

3.子宮肌瘤：子宮平滑肌瘤是女性最常見的良性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8在人類平滑肌瘤中較正常子宮肌細胞表達升高[39]。Islam等[3]用GDF-8處理子宮原代肌層細胞和肌瘤細胞后發(fā)現(xiàn)，GDF-8通過激活Smad2/3信號通路降低子宮肌層細胞增殖細胞核抗原和Ki-67表達，發(fā)揮抗纖維化的作用，而不影響肌瘤細胞的增殖，有可能為子宮肌瘤分子診療措施的提出提供依據(jù)。

4.子宮腺肌癥：子宮腺肌癥好發(fā)于絕經(jīng)前婦女，主要癥狀有異常子宮出血(AUB)，低生育能力和較高的流產(chǎn)率[40]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8及其Ⅱ型受體在子宮腺肌癥中高表達，推測GDF-8受體擴增可能在腺肌癥導致的不孕中發(fā)揮作用[41]。Harmsen等[42]研究發(fā)現(xiàn)，腺肌癥組患者GDF-8的表達水平高于對照組，這提示GDF-8參與子宮脆性和滲透性較高血管的生成過程，可能與腺肌病相關(guān)的AUB和生育能力低下有關(guān)，為該疾病提供了一個可能的治療靶點。

5.子宮內(nèi)膜腫瘤：GDF-8及其受體在正常子宮內(nèi)膜以及內(nèi)膜良惡性腫瘤中表達存在差異。GDF-8及受體在良性腫瘤，如卵巢子宮內(nèi)膜瘤(OMA)和子宮內(nèi)膜息肉中表達升高。GDF-8在深浸潤性子宮內(nèi)膜異位癥(DIE)和子宮內(nèi)膜癌中表達最高，而GDF-8受體在子宮內(nèi)膜癌和腺癌中的表達最高。GDF-8及其受體的這種差異性分布提示，GDF-8參與了人類子宮內(nèi)膜相關(guān)病理[14]，但為了更好地理解GDF-8及其相關(guān)蛋白在子宮內(nèi)膜生理和病理中的作用，還需要進一步的研究。

6.妊娠期糖尿病(GDM)：GDM是指妊娠期母體葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗。Peiris等[43]研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者血清GDF-8水平與正常妊娠組相比無顯著差異，而胎盤中GDM患者GDF-8水平顯著低于正常妊娠組。經(jīng)胰島素治療組患者胎盤GDF-8水平高于飲食療法組，更接近正常對照組。由此，Peiris等[43]提出，GDF-8于胎盤組織的表達在應激條件下(如糖代謝異常)發(fā)生改變，通過影響胎盤組織葡萄糖穩(wěn)態(tài)，改變胎盤的功能，可能與GDM的葡萄糖耐受不良相關(guān)。

7.子癇前期(PE)和宮內(nèi)生長受限(IUGR)：PE和IUGR是導致母體、胎兒和新生兒預后不良的主要妊娠疾病。研究證實，GDF-8在PE、IUGR以及PE合并IUGR孕婦血清和胎盤中顯著升高[4]。在體外培養(yǎng)胎盤組織中，GDF-8治療促使妊娠早期胎盤組織產(chǎn)生的細胞因子發(fā)生改變，即從Th1細胞因子(促炎)環(huán)境轉(zhuǎn)移到成功妊娠所需的Th2細胞因子(抗炎)環(huán)境，說明GDF-8在合并PE和IUGR的復雜妊娠中發(fā)揮有利作用[4]。

四、GDF-8在輔助生殖中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，在接受IVF助孕患者控制性超促排卵(COH)過程中，妊娠組與非妊娠組血清GDF-8水平動態(tài)變化趨勢相似，但在HCG日和ET后14 d血清GDF-8水平有顯著差異，提示血清GDF-8水平與妊娠結(jié)果關(guān)系密切[44]。目前，已知HCG日孕酮提前升高可以降低胚胎著床率、妊娠率和活產(chǎn)率，且血清GDF-8水平與孕酮水平呈負相關(guān)[19，45]。由此，我們推測GDF-8變化預測妊娠結(jié)局的主要機制為：在HCG使用前，較高水平的GDF-8通過保持較低的血清孕酮水平對妊娠有利；而HCG作用后，低水平的GDF-8維持高水平的孕酮對早期胚胎著床至關(guān)重要，因此，血清GDF-8水平是IVF/ICSI-ET治療患者妊娠的一個有價值的預測因子[44]。

另外，在IVF過程中PCOS患者卵泡液GDF-8水平顯著高于非PCOS患者，顆粒細胞中基礎(chǔ)ALK5水平增加，而StAR水平降低，且GDF-8對StAR的抑制作用更加顯著[2]。GDF-8和ALK5的高基礎(chǔ)表達水平可能導致PCOS患者顆粒細胞中StAR和孕酮異常下調(diào)，這可能導致不良的妊娠結(jié)局。相比之下，在非PCOS患者中，通過保持相對較低StAR和孕酮水平以防止過早黃素化，較高水平的GDF-8可能對妊娠有益，因此，GDF-8在PCOS患者卵泡液中的異常表達可能是治療PCOS的潛在新靶點[2]。

五、總結(jié)

綜上所述，GDF-8廣泛參與卵泡發(fā)育、排卵、胎盤功能及生殖疾病調(diào)控過程，且在輔助生殖技術(shù)助孕患者妊娠調(diào)控中具有重要作用，但其在人體胚胎發(fā)育的作用以及不孕相關(guān)疾病發(fā)生的分子機制仍有待深入研究，在此基礎(chǔ)上進一步探索女性生殖障礙疾病的新型分子靶標和診療措施。