劉慧敏，劉曉利，王欣惠，楊志云，江宇泳

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有早期診斷困難、惡性程度高、發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。大部分PLC由肝炎病毒感染發(fā)展形成，每年死于PLC的患者超過40萬[1]，顯著高于西方發(fā)達(dá)國家。當(dāng)前，治療PLC的方法主要有手術(shù)切除、局部栓塞或消融和肝移植等[2, 3]。近些年，免疫治療肝癌成為研究的熱點(diǎn)[4]。Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是CD4+T細(xì)胞亞群的一種，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在一定條件下這兩種細(xì)胞相互轉(zhuǎn)化以維持人體自身免疫功能的穩(wěn)定，在抗腫瘤免疫過程中也發(fā)揮著重要的作用。越來越多的證據(jù)表明Th17/Treg細(xì)胞比值失衡促進(jìn)了炎癥和腫瘤進(jìn)展，以調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞比值平衡為靶點(diǎn)的免疫療法為肝癌的治療提供了新的策略[5-7]。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測了PLC患者外周血CD4+T、CD8+T及Tc17、Th17和Treg淋巴細(xì)胞，以了解它們的變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年6月～2019年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院診治的PLC患者83例，男性46例，女性37例；年齡27～75歲，平均年齡為(45.1±7.3)歲。診斷參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[8]，采用巴塞羅那臨床肝癌分期(BCLC 2010)[9]，其中A期25例，B期23例，C期18例，D期17例。排除轉(zhuǎn)移性肝癌及合并其他惡性腫瘤、有嚴(yán)重的心、腎疾病、失代償期肝硬化、妊娠或哺乳期婦女。另選擇同期35例健康體檢者作為對照，男性23例，女12例；年齡25～73歲，平均年齡為(42.2±6.8)歲。本研究方案和研究內(nèi)容已得到北京地壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：京地倫科字[2018]第(028)-02號)，患者簽署知情同意書。

1.2 外周血CD4+和CD8T+淋巴細(xì)胞檢測 取新鮮抗凝全血100 μL，加入流式管，加入抗CD3-FITC(Invitrogen，批號11-0037-42)、抗CD4-PE(Invitrogen，批號15-0041-82)、抗CD8-APC(Invitrogen，批號MHCD0805)鼠抗人單克隆抗體，充分混勻，4℃避光孵育45 min。加入紅細(xì)胞裂解液2 ml， 避光孵育10 min，加入預(yù)冷流式緩沖液2 mL，洗滌，1500 r/m 離心5 min，棄上清，重復(fù)一次。加預(yù)冷2%多聚甲醛-PBS 300μL重懸，4℃避光保存，上機(jī)檢測，分析外周血T細(xì)胞各亞群的比例。先根據(jù)前向散射角(FCS)和側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細(xì)胞群，然后以CD3+設(shè)門，分析CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的百分率。

1.3 外周血Th17 細(xì)胞檢測 采用密度梯度離心法分離肝癌患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，然后加入RPMI 1640培養(yǎng)基10 mL潤洗，經(jīng)室溫1500 r/m離心[離心半徑(r)=11.5 cm]10 min，去除淋巴細(xì)胞分離液；再次潤洗PBMC；加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整單細(xì)胞懸液為2×106/mL，取500 μL，均分入流式管、待用。調(diào)整每管細(xì)胞數(shù)為1×106個。于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1×106個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，至總體積為400μL，再加入PMA細(xì)胞刺激劑(終濃度為2μL/mL)，37℃ CO2孵箱，刺激培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞，加入胞外抗CD4和抗CD8，室溫避光孵育30 min，然后以PBS清洗細(xì)胞碎片和未結(jié)合抗體，加入A液100 μL固定，室溫閉光15 min；加入PBS 2 mL，1200 r/m離心5 min，棄上清，加入B液50 μL，破膜，隨后加入胞內(nèi)抗IL-17A-FITC (Ebioscience，批號11-7179-42)，上機(jī)檢測。

1.4 外周血Treg細(xì)胞檢測 采用密度梯度離心法分離外周血PBMCs，加入RPMI 1640培養(yǎng)基10 mL，經(jīng)室溫1500 r/m離心10 min，去除淋巴細(xì)胞分離液，潤洗PBMC；加入RPMI1640培養(yǎng)基10 mL重懸細(xì)胞，取一部分用于表面染色。具體染色方案為：鼠抗人CD45RA(AF700)、抗CD3(BV786)、抗CD4(APC/FireTM750)、抗CD8(BV510)和抗CD25(PE-CF594)，室溫下避光30 min，然后上高端分析型流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessa)檢測。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+細(xì)胞比值比較 PLC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+細(xì)胞比值顯著低于健康人(P<0.05，表1和圖1)。

表1 兩組外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+細(xì)胞比值比較

與健康人比，P<0.05

2.2 兩組外周血Th17、Treg細(xì)胞及Th17/Treg細(xì)胞比值比較 見表2、圖2。

表2 兩組外周血Th17、Treg細(xì)胞及Treg/Th17比值比較

圖1 兩組外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比變化

圖2 兩組外周血Th17、Tc17和Treg細(xì)胞百分比變化

3 討論

隨著腫瘤免疫學(xué)研究的深入，提出了“腫瘤微環(huán)境”的概念。各種類型的細(xì)胞、周圍基質(zhì)、細(xì)胞因子、血管和淋巴管、腫瘤細(xì)胞及相關(guān)物理因素等共同構(gòu)成了復(fù)雜的腫瘤內(nèi)環(huán)境網(wǎng)絡(luò)。腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究報道，免疫細(xì)胞的失衡和慢性炎癥反應(yīng)是PLC形成的重要因素。CD4+T細(xì)胞主要可分化為Th1、Th2、Treg和Th17細(xì)胞4個亞群。在不同的免疫應(yīng)答階段，因局部微環(huán)境中細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的不同而分化為不同的T細(xì)胞亞群，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。既往研究表明，肝癌的腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫細(xì)胞和炎性因子，肝癌組織免疫細(xì)胞亞群數(shù)量和表型與肝癌的發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)[10, 11]。因此，研究肝癌腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的失衡能更準(zhǔn)確地反映宿主的免疫功能狀態(tài)，從而指導(dǎo)臨床治療。

CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮不同的作用，其組成和功能等特征在一定程度上反映了機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的性質(zhì)和水平。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLC患者外周血CD4+T細(xì)胞水平顯著降低，存在CD4+T與CD8+T比例的失衡。T淋巴細(xì)胞比例失衡改變了腫瘤的免疫微環(huán)境，從而有利于腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。CD8+T 細(xì)胞中亦存在一群可分泌IL-17的細(xì)胞，并被命名為CD8+IL-17+細(xì)胞(Tc17)。Tc17細(xì)胞是一組與經(jīng)典的CD8+T細(xì)胞不同的新亞型，其主要通過釋放炎性細(xì)胞因子，如IL-17、IL-22和TNF-α等，從而誘發(fā)嚴(yán)重的免疫相關(guān)性疾病[12]。既往對Tcl7百分比和功能研究較少，但Tcl7在肝癌局部腫瘤微環(huán)境中同樣發(fā)揮重要作用[13]。研究顯示，Tc17細(xì)胞主要通過釋放IL-17和TNF-α等細(xì)胞因子介導(dǎo)強(qiáng)大的促炎作用，促進(jìn)腫瘤血管的生成，從而在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，PLC患者外周血Tc17(CD8+IL-17)細(xì)胞百分比顯著升高，提示Tc17(CD8+IL-17)參與了腫瘤微環(huán)境的改變，與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

Th17細(xì)胞是一種高分泌白介素-17(interleukin-17，IL-17)的CD4+T細(xì)胞亞群，由初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-6聯(lián)合作用下分化而來。Th17細(xì)胞作為重要的促炎反應(yīng)細(xì)胞，可通過激活樹突狀細(xì)胞和T淋巴輔助細(xì)胞，誘導(dǎo)并激活多種細(xì)胞因子，維持慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)，形成導(dǎo)致癌變的微環(huán)境[15]。此外，Th17細(xì)胞可分泌IL-17、TNF-α、IL-21等細(xì)胞因子，其中IL-17是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)其他趨化因子、促炎細(xì)胞因子和金屬蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)一步加重炎性細(xì)胞浸潤和組織損傷[16]。研究報道，Th17(CD4+IL-17)在肝癌和癌旁組織顯著增多，參與了腫瘤的血管浸潤，其分泌的IL-17可通過NFκB途徑誘導(dǎo)金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。此外，另有研究顯示高表達(dá)IL-17的肝癌細(xì)胞侵襲能力、轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，惡性程度也更高[18]。本研究中，肝癌患者外周血Th17(CD4+IL-17)細(xì)胞百分比顯著升高，并且與腫瘤的分期密切相關(guān)，提示Th17(CD4+IL-17)參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，高水平的Th17(CD4+IL-17)預(yù)示更晚期的惡性腫瘤。

Treg細(xì)胞是初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β獨(dú)立誘導(dǎo)下分化而來，是一類具有免疫抑制效應(yīng)功能的細(xì)胞，能調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，減輕免疫損傷，通過抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答介導(dǎo)免疫逃逸,從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[19]。研究顯示，惡性腫瘤患者外周血Treg數(shù)量顯著增加，一方面腫瘤組織中大量累積的Treg細(xì)胞通過激活CD69細(xì)胞和人類白細(xì)胞DR抗原抑制T細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌；另一方面進(jìn)一步破壞CD8+T細(xì)胞使之失去有效的抗腫瘤能力，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[20]。Treg細(xì)胞還可下調(diào)自然殺傷細(xì)胞表面活性受體D2并分泌抗炎因子TGF-β和IL-10，從而抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤功能，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[21]。本研究結(jié)果顯示，PLC患者外周血CD4+CD25+CD45RA+Treg細(xì)胞比例顯著高于健康人，且與腫瘤分期密切相關(guān)，提示在PLC的發(fā)病過程中存在Treg細(xì)胞增殖。

綜上所述，PLC患者外周血淋巴細(xì)胞亞群存在免疫失衡，CD4+T、CD8+T、Tc17、Th17、Treg細(xì)胞比例失衡與患者腫瘤分期密切相關(guān)。從免疫學(xué)角度開展針對調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞失衡的免疫治療可能是抗腫瘤的有效策略。