馬國斌，趙曉宏，趙 鵬，楊 冰

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種累及肝臟實質的特發(fā)性疾病，以血清γ-球蛋白增高和對免疫抑制劑治療應答為臨床特點[1]。相關研究指出，由Treg細胞分泌的白介素-35(interleukin-35，IL-35，又稱為EB病毒誘導蛋白3，Epstein-Barr virus-induced gene 3，Ebi3)與多種自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關[2]。IL-35是IL-12家族成員，由Ebi3蛋白和p35亞基組成異源二聚體，可直接發(fā)揮免疫抑制作用，并能調節(jié)Treg細胞分化，抑制Th17細胞亞群分化和增殖，進而可對過度免疫反應起到一定的抑制作用。有學者發(fā)現(xiàn)，髓樣抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)百分比異常與肝癌的發(fā)生存在密切的關聯(lián)[3]。MDSCs是髓系來源的異質性細胞，由骨髓祖細胞與未成熟的骨髓細胞組成，為免疫調節(jié)細胞，可負性調節(jié)適應性免疫應答[4]，但目前對于IL-35和MDSCs與AIH發(fā)病的關系尚處于探索階段。本研究檢測了AIH患者肝組織IL-35表達和外周血MDSCs百分比變化，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年5月～2020年2月我院收治的AIH患者35例，男5例，女30例；年齡為34～59歲，平均年齡為(45.1±6.8)歲。符合《自身免疫性肝炎診斷和治療共識(2015年)》[5]中關于AIH的診斷標準。排除標準：(1)嚴重的心腦血管疾?。?2)合并乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染；(3)肝硬化；(4)既往有肝臟手術史；(5)存在其他嚴重的免疫系統(tǒng)疾??；(6)存在惡性腫瘤。

1.2 肝組織IL-35表達檢測 常規(guī)肝穿刺活檢取得肝組織，自液氮凍存管中取出肝組織，用生理鹽水洗滌，取100 mg，加入細胞裂解液100 μL和蛋白酶抑制劑2 μL，充分勻漿，于液氮中凍融3次，低溫高速離心后取上清液60 μL，應用蛋白定量試劑盒進行蛋白定量分析。取蛋白160 μg，用無菌超純水將肝組織體積補充至20μL，將入還原劑和緩沖液補充終體積至60 μL，于75℃水浴中煮5 min，-20℃保存。緩慢加入10%分離膠溶液，添加去離子水封頂，常溫下放置1 h，待其完全凝固后傾倒出上層去離子水，按同法添加積層膠，常溫下放置40 min，待其完全凝固，使用北京六一實驗設備廠生產(chǎn)的DYY-10型電泳儀，在電泳槽中加滿1×SDS電泳緩沖液，用注射針頭調整各個孔的膠體至準確位置，排出氣泡。加入蛋白80μg，在電泳槽中放入冰盒，電泳1 h。當溴酚藍印跡線到達凝膠底部時關閉電源，終止電泳。取出凝膠，切去基層膠和多余的分離膠，將膠塊泡在電泳緩沖液中備用。用甲醇液浸泡5 min，轉入電轉移液中浸泡。根據(jù)目的蛋白分子量大小和預實驗結果確定電轉移時間，轉膜結束后取出轉移膜，制作封閉液，將纖維素膜放入含有5 ml封閉液的封口袋中封閉2 h。按照稀釋比例(1：500)配制羊抗人p35抗體(英國Abcam公司)、鼠抗人Ebi3單抗(英國Novus公司)或抗β-actin(英國Abcam公司)，稀釋比例為1：100，4℃下過夜。分別加入適量的1×TBS-T稀釋辣根HRP標記的羊抗大鼠IgG(北京普利萊技術公司，1：5000)或辣根HRP標記的兔抗山羊IgG(索萊寶技術有限公司，1：5000)，室溫下孵育2 h，用1×TBS-T洗膜3次。按照說明書配制超敏發(fā)光液，均勻滴加至纖維膜正面，于德國Lecia顯影儀曝光，調整至合適的灰度值。

1.3 外周血MDSCs百分比檢測 采集外周靜脈血3 ml，抗凝，避光孵育20 min，加溶血素1 mL，混勻，離心，分離血清。加入1×Fix/Perm Buffer 1 mL，離心，棄上清液，加入熒光標記的抗細胞表面特異性抗原(抗CD14-PE、抗CD11b-FITC、抗CD33-Cy5、抗HLA-DR-ECD，美國BD公司)各5 μL，混勻，在4℃環(huán)境下孵育45 min，重復該操作一次。使用美國CytoFLEX公司生產(chǎn)的LX型流式細胞儀測定MDSCs百分比。

1.4 病情嚴重程度判定 參照《自身免疫性肝炎診斷和治療共識(2015年)》[5]，根據(jù)界面破壞范圍和細胞浸潤深度分度，輕度：局部或少數(shù)門管區(qū)破壞；中度：<50%門管區(qū)或纖維間隔破壞；重度：≥50%門管區(qū)或纖維間隔破壞。

1.5 肝組織學檢查 常規(guī)行病理學檢查，采用Knodell組織學活動度指數(shù)積分系統(tǒng)進行炎癥活動度分級和纖維化分期[6]。

1.6 治療與應答 給予潑尼松30～60 mg.d-1或波尼松聯(lián)合硫唑嘌呤50 mg.d-1治療。根據(jù)患者病情控制情況，將潑尼松逐漸減量至5～10 mg.d-1。參照《自身免疫性肝病的診治：從共識到指南》[5]，完全應答為血化學指標緩解，即血清轉氨酶和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)水平均恢復正常。

2 結果

2.1 不同病情嚴重程度患者肝組織蛋白表達和外周血MDSCs百分比比較 重度組肝組織p35和Ebi3表達及外周血MDSCs百分比顯著高于輕度或中度組，中度組MDSCs百分比顯著高于輕度組(P<0.05，表1)。

表1 三組肝組織蛋白表達和外周血MDSCs百分比比較

2.2 不同肝纖維化和炎癥分級患者肝組織IL-35表達和外周血MDSCs百分比比較 纖維化分期S3～S4期患者p35和Ebi3表達及MDSCs百分比顯著高于S1～S2期，炎癥分級G3～G4級患者p35和Ebi3表達及MDSCs百分比顯著高于G1～G2級(P<0.05，表2)。

表2 不同肝纖維化分期和炎癥分級患者肝組織IL-35表達和MDSCs百分比比較

2.3 不同治療時間應答患者肝組織IL-35表達和外周血MDSCs百分比比較 本組AIH患者經(jīng)治療均獲得完全應答，但<3個月應答組肝組織p35和Ebi3表達顯著低于3～6個月或>6個月應答組(P<0.05，表3)。

表3 不同時間應答患者IL-35表達和MDSCs百分比比較

3 討論

界面性肝炎是AIH組織學特征之一，主要是因門管區(qū)炎癥導致門管區(qū)或纖維間隔相鄰的肝細胞壞死引起的，多表現(xiàn)為界面處肝細胞呈單個或小簇狀壞死、脫落，導致小葉界面呈“蟲蛀”狀改變[7,8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫性疾病、炎癥性疾病和冠心病等的發(fā)生都與IL-35過表達有關[9,10]。IL-35是IL-12家族成員，是由EB病毒誘導基因3編碼蛋白和p35兩個亞基組成的異源二聚體，屬于Ⅰ型細胞因子超家族成員，與IL-12等具有部分同源性，為新型抗炎因子，其可擴增Treg細胞數(shù)量，可抑制效應性T細胞的產(chǎn)生，并能抑制Th17細胞分化，進而可抑制和減輕炎癥反應[11,12]。MDSCs是未成熟的髓系細胞亞群，目前認為其可抑制機體對細菌感染、病毒等疾病的免疫應答，且能夠誘導調節(jié)性T細胞和增加L-精氨酸的代謝等途徑發(fā)揮作用[13,14]。當機體受到感染或免疫功能遭到破壞時，未成熟的骨髓細胞分化被阻斷，導致MDSCs大量產(chǎn)生，聚集于血液、骨髓等部位，高表達免疫抑制分子，可發(fā)揮免疫調控功能。本研究發(fā)現(xiàn)，重度AIH患者肝組織p35表達和外周血MDSCs百分比顯著高于輕度組或中度組，中度組顯著高于輕度組，說明肝組織IL-35表達和外周血MDSCs百分比與界面性肝炎嚴重程度有關。

肝組織炎癥反應是保護肝細胞免受傷害，促進組織損傷修復，但炎癥反應太過強烈則會對肝實質造成不可逆的損害[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，纖維化分期和炎癥分級較高患者的肝組織IL-35表達和外周血MDSCs百分比較高。MDSCs可通過抑制T細胞增殖和活化起到負向調控機體免疫應答作用[17,18]，肝炎的發(fā)生可導致MDSCs增殖、聚集，但其過度表達則會導致機體免疫功能紊亂，進而加重肝功能損傷。

治療AIH的目標主要在于緩解臨床癥狀，防止疾病進展[19]。目前，多采用潑尼松等藥物治療，但不同患者的治療應答速度不同，可能會對預后造成影響[20]。本研究結果顯示，治療不同時間應答患者肝組織p35表達和外周血MDSCs百分比顯著不同，遲遲不能應答患者蛋白表達和細胞百分比顯著增強或升高，說明治療應答時間越短，患者肝組織IL-35表達和外周血MDSCs百分比越低，可能與IL-35表達弱和外周血MDSCs水平較低患者肝組織損傷較輕有關。