金宇晨，柴隆龍，馬 倩，熊燕飛，張建坤，陳碧峰

（1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430014；2.湖北森寶園藝有限公司，湖北 荊門 431815）

對(duì)節(jié)白蠟（Fraxinus hupehensis），又名湖北梣、湖北白蠟，是木犀科梣屬落葉大喬木，樹(shù)皮深灰色，老時(shí)縱裂；營(yíng)養(yǎng)枝常呈棘刺狀。喜光，稍耐寒，耐干旱、瘠薄，適應(yīng)性強(qiáng)。產(chǎn)自中國(guó)湖北京山等地，北京等地也有栽培。對(duì)節(jié)白蠟生長(zhǎng)緩慢，壽命長(zhǎng)，樹(shù)形優(yōu)美，盤根錯(cuò)節(jié)，是園林、盆景、根雕家族中的極品，被譽(yù)為“活化石”和“盆景之王”［1］。

2013 年在對(duì)節(jié)白蠟天然種群中發(fā)現(xiàn)1 株冠形緊湊、樹(shù)形優(yōu)美的品種，經(jīng)中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所鑒定為新品種，命名為“京翠”。與對(duì)節(jié)白蠟相比，“京翠”具有葉色翠綠，葉片大，樹(shù)冠緊湊，樹(shù)型優(yōu)美，無(wú)需修剪，自然成型的特點(diǎn)。從2014 年開(kāi)始，湖北省京山市林業(yè)局就開(kāi)展了“京翠”品種繁育推廣試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)5 年的試驗(yàn)，形成了較為成熟的“京翠”品種繁育推廣技術(shù)［2］。

為探索對(duì)節(jié)白蠟與“京翠”的遺傳距離和遺傳一致性，采用葉綠體微衛(wèi)星（Chloroplast microsatellite，cpSSR）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)“京翠”和對(duì)接白蠟展開(kāi)研究，并對(duì)其他物種的相關(guān)cpSSR 數(shù)據(jù)進(jìn)行了匯總分析，旨在從分子水平上揭示兩者的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”樣本均取于湖北省京山市虎爪山林場(chǎng)。依據(jù)隨機(jī)取樣原則，在對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”的居群內(nèi)隨機(jī)挑選3 棵胸徑30 cm 以上成熟的大樹(shù)（相距10 m 以上），每棵樹(shù)上采集20～30 g當(dāng)年生嫩葉，置于冰盒內(nèi)冷藏保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取 采用TIANGEN 公司的DNAsecure 新型植物基因組DNA 提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit，DP320-02），取100 mg 樣本幼葉組織，經(jīng)液氮冷凍研磨成粉末后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。

1.2.2 cpSSR 引物合成 cpDNA 相對(duì)保守，cpSSR突變率較低，故cpSSR 引物的通用性較高。本研究選取22 對(duì)通用cpSSR 引物［3，4］用于節(jié)白蠟和“京翠”基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增（表1），22 對(duì)引物均由武漢生工生物公司合成。

表1 22 對(duì)cpSSR 引物序列

1.2.3 cpSSR-PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序 cpSSRPCR 反應(yīng)體系為0.1 μL Taq 酶、2 μL Taq 酶buffer、1 μL cpSSR primer（上游+下游）、1.5 μL 模版DNA（20 ng/μL）、10.2 μL RNase-Free Water、0.2 μL dNTP，反應(yīng)總體系為15 μL。由于引物退火溫度的差異，為22 對(duì)cpSSR 引物優(yōu)化出2 套PCR 擴(kuò)增程序（表2）［5］。反應(yīng)結(jié)束后PCR 產(chǎn)物置于4 ℃保存，待凝膠電泳檢測(cè)。

表2 22 對(duì)cpSSR 引物的PCR 擴(kuò)增程序

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 在電泳圖譜中，同一位置的條帶被視作1 個(gè)位點(diǎn)，根據(jù)同一位置上是否有條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶的記為“1”，無(wú)帶記為“0”。以對(duì)節(jié)白蠟的條帶為標(biāo)準(zhǔn)，記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。利用軟件POPGENE1.31 計(jì)算樣本數(shù)據(jù)的遺傳一致度及遺傳距離。利用NTSYS-pc2.10 軟件根據(jù)居群間的Nei's 遺傳一致度，對(duì)樣本數(shù)據(jù)及其他物種的相關(guān)cpSSR 的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA 聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpSSR-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”基因組DNA 經(jīng)22 對(duì)cpSSR引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。對(duì)“京翠”與對(duì)節(jié)白蠟的3 對(duì)樣本分別進(jìn)行cpSSR-PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)，凝膠電泳結(jié)果均一致。引物擴(kuò)增結(jié)果特異性強(qiáng)，條帶清晰且單一，擴(kuò)增片段主要集中在100～500 bp，與預(yù)測(cè)產(chǎn)物條帶大小的范圍一致［6］。

圖1 對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”基因組PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物的凝膠電泳

2.2 遺傳一致度和遺傳距離

該研究共提取了ccmp1—ccmp10 引物在其他物種中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，與對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，對(duì)節(jié)白蠟、“京翠”及其他物種間的遺傳一致度和遺傳距離的結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，對(duì)節(jié)白蠟、“京翠”及其他物種間的Nei's 遺傳距離值范圍為0.066 8～0.916 3，遺傳一致度范圍為0.250 0～0.933 3，說(shuō)明所選物種之間特異性明顯，條帶差異大。其中“京翠”與對(duì)節(jié)白蠟的遺傳一致度為0.461 5，遺傳距離為0.602 0，說(shuō)明兩者的遺傳一致度較高，但兩者間的遺傳距離較大。此外，對(duì)22 對(duì)cpSSR 引物擴(kuò)增后的凝膠電泳圖譜結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”的遺傳一致度為0.454 5，遺傳距離為0.788 5，該結(jié)果與10 對(duì)引物（ccmp1—ccmp10）計(jì)算結(jié)果一致。

表3 對(duì)節(jié)白蠟、“京翠”及其他物種間的遺傳一致度和遺傳距離

2.3 cpSSR 遺傳聚類分析

基于ccmp1—ccmp10 引物擴(kuò)增結(jié)果分析得到的遺傳一致度，對(duì)上述物種進(jìn)行UPGMA 遺傳關(guān)系聚類分析，結(jié)果如圖2 所示。從聚類圖可以看出，對(duì)節(jié)白蠟、“京翠”和其他物種共同聚成5 個(gè)大類：第Ⅰ類包括“京翠”和豆科；第Ⅱ類為對(duì)節(jié)白蠟、茄科、獼猴桃科、薔薇科和桃金娘科；龍舌蘭科、禾本科和十字花科分別歸屬于第Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類。

圖2 不同物種間的UPGMA 遺傳關(guān)系聚類結(jié)果

3 小結(jié)與討論

“京翠”自2018 年被培育出來(lái)，其與對(duì)節(jié)白蠟之間的親緣關(guān)系鮮有研究。葉綠體微衛(wèi)星（cpSSR）是1 種新型的標(biāo)記技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用到植物種群遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)分析、種群分類、系統(tǒng)地理分布等方面研究。由于微衛(wèi)星（SSR）兩側(cè)的堿基序列具有很強(qiáng)的保守性［7］，因此1 個(gè)引物可以在另外1個(gè)物種上進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增，稱之為“種間擴(kuò)增”［8］。而cpSSR 不僅有SSR 的優(yōu)點(diǎn)，還能兼顧到cpDNA 獨(dú)立進(jìn)化的特點(diǎn)，可以通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)物種的葉綠體DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性可用作分子標(biāo)記。采用cpSSR 分子標(biāo)記方法，首次從分子水平上揭示對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”的親緣關(guān)系，為對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”之間的發(fā)育進(jìn)化關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

本研究中，首先選用了10 對(duì)通用cpSSR 引物對(duì)對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”樣本的總基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)“京翠”與對(duì)節(jié)白蠟的遺傳一致度為0.461 5，遺傳距離為0.602 0。這10 對(duì)cpSSR 引物的PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立聚類圖譜發(fā)現(xiàn)，薔薇科與桃金娘科聚在同一支上，并且遠(yuǎn)離龍舌蘭科和禾本科，豆科和十字花科之間的距離則相對(duì)較遠(yuǎn)。對(duì)節(jié)白蠟與“京翠”的親緣關(guān)系并不近，可能是該研究的cpSSR 位點(diǎn)數(shù)量不足，不能充分評(píng)估對(duì)節(jié)白蠟與“京翠”之間的親緣關(guān)系。

此外，利用22 對(duì)引物重新對(duì)對(duì)節(jié)白蠟和“京翠”的基因組總DNA 樣本進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)凝膠電泳獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳一致性和遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，2 者的遺傳距離和遺傳一致性未發(fā)生較大改變。綜合分析，對(duì)節(jié)白蠟與“京翠”之間確實(shí)存在親緣關(guān)系，但2者的親緣性并不大。考慮到對(duì)節(jié)白蠟不同居群之間存在較大的遺傳多樣性［9］，后續(xù)的研究還需納入更多不同的對(duì)節(jié)白蠟居群樣本，以及野生“京翠”植株的樣本，進(jìn)行更精細(xì)的種內(nèi)比對(duì)。同時(shí)分子標(biāo)記技術(shù)具有擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)誤差較大等缺點(diǎn)，在今后研究中，需采取多種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行綜合比較分析，才能更加全面、準(zhǔn)確地解析對(duì)節(jié)白蠟與“京翠”之間的親緣關(guān)系。