林帥超，白銀龍，熊建利

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023）

硒是維持生物正常生長所必需的微量元素之一，地殼中含量極少，自然界中多以無機(jī)硒和有機(jī)硒的形式存在［1］。早期硒常被誤認(rèn)為有毒物質(zhì)，隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過氧化物酶酶系的必需組成成分，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗氧化、消除體內(nèi)自由基、保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)免受過氧化損傷等作用［2］。硒還具有提高機(jī)體免疫力、提高動(dòng)物繁殖力、減弱重金屬毒性［3，4］、防止癌癥的發(fā)生［5，6］等功能。

維持并促進(jìn)正常的生物生理機(jī)能所需的硒含量是極微的，硒缺乏和過量均會(huì)對生物體正常生命活動(dòng) 產(chǎn) 生 不 利 影 響。Ferguson 等［7］指 出 大 西 洋 鮭（Salmo salar）硒缺乏會(huì)導(dǎo)致胰腺肌肉組織發(fā)生病變，肌氨酸激酶含量升高，血漿蛋白含量降低。Deforest 等［8］研究表明溫水性魚類飼料硒的臨界值為10 mg/g，冷水性魚類飼料中的硒臨界值為11 mg/g；飼料中硒含量在4.6～6.5 mg/kg 時(shí)，兩種魚類都會(huì)受到不同程度的負(fù)面影響。孫德文等［9］發(fā)現(xiàn)11.4 mg/kg的硒飼料會(huì)導(dǎo)致虹鱒的體重減輕、死亡率升高，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)近90%的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）腎臟組織損傷，不溶性鈣鹽沉積導(dǎo)致腎鈣含量明顯增加。

近年來，硒對水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)生理作用的影響已有諸多研究。在大西洋鮭［10］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［11］、點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）［12］、虹鱒［13］、河鱸（Lates calcarifer）［14］、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）［15］等經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的名優(yōu)水產(chǎn)魚類的研究較多，對淡水大宗養(yǎng)殖魚類的研究較少。梁達(dá)智等［16］以特定生長率為評價(jià)指標(biāo)確定斜帶石斑魚飼料中硒的最適需要量為0.98～1.01 mg/kg。Lin 等［17］以魚體增重和全魚硒含量的線性回歸為依據(jù)確定點(diǎn)帶石斑幼魚的最適硒需求量為0.70 mg/kg。Zhu等［18］以最佳生產(chǎn)性能和抗氧化能力綜合評估大口黑鱸日糧所需硒適宜添加量為1.60～1.85 mg/kg。而硒對水產(chǎn)魚類血液的影響僅見少量報(bào)道。Le 等［19］在黃尾金魚、Abdel 等［20］在非洲鯰魚的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)魚體血液中紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量隨著飼料中硒含量的增加而增加，表明日糧中添加硒可以顯著增強(qiáng)血液攜氧能力。黃河鯉魚（Cyprinus carpio）是主要分布在中國黃河流域的一種雜食性淡水魚類，生長周期較短、耐受力強(qiáng)，因其體型肥碩、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富而成為中國主要養(yǎng)殖品種之一。本試驗(yàn)以黃河鯉魚為研究對象，在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的硒，檢測其對黃河鯉魚血液參數(shù)的影響，為硒在鯉魚健康、綠色、高效養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 飼料的制備

基礎(chǔ)飼料購自河南省洛陽孟津同創(chuàng)飼料廠，以進(jìn)口魚粉為主要蛋白質(zhì)源，以大豆、卵磷脂為主要脂肪源，詳細(xì)配方見表1?；A(chǔ)飼料中亞硒酸鈉（購自Sigma-Aldrich 公司，濃度≥98%）的添加水平分別為0（對照組）、0.25、0.50、1.00 mg/kg?；A(chǔ)飼料粉碎后過篩（80 目）后，將亞硒酸鈉采用逐級擴(kuò)大法和基礎(chǔ)飼料混勻后，加水用制粒機(jī)制成（2.0 mm×2.0 mm）的硬性顆粒，60 ℃烘箱烘干后置于陰涼處密封保存。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 主要儀器

血紅蛋白計(jì)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、瑞氏染色液（購自Solarbio 公司）、粉碎機(jī)（速爾SE-2000）、血液微量毛細(xì)吸管離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)開發(fā)有限公司-TG12）、顯微鏡拍照系統(tǒng)（OLYMPUS CX31）、Biolife Std 顯微圖像分析軟件。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用魚為洛陽黃河鯉魚養(yǎng)殖場提供的當(dāng)年同批次健康黃河鯉魚幼魚，養(yǎng)殖試驗(yàn)在河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將240 尾體重（17.21±1.73）g、體長（11.11±0.46）cm 的幼鯉隨機(jī)分為4 個(gè)組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 尾魚。先用基礎(chǔ)飼料飼喂1 周后，分別飼喂添加0、0.25、0.50、1.00 mg/kg亞硒酸鈉的飼料，試驗(yàn)周期為8 周。每日更換1/3 的水，并清除水箱內(nèi)的排泄物及殘餌；飼料的投放按照定時(shí)、定點(diǎn)和定量的原則，早8：00 和晚20：00 投喂，飼喂量為魚體重的3%。試驗(yàn)期間采用水箱養(yǎng)殖（55 cm×40 cm×40 cm），增氧機(jī)24 h 充氧保證溶氧量大于5 mg/L，pH 為6.5～7.0，溫度控制在22～26 ℃，氨氮含量不超過0.5 mg/L，亞硝酸含量小于0.1 mg/L。試驗(yàn)期間及時(shí)清理死魚。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

1.4.1 樣品采集 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，黃河鯉魚幼魚禁食24 h 后，用100 mg/L 丁香酚輕微麻醉試驗(yàn)魚，對每個(gè)養(yǎng)殖水箱中的魚稱重并記錄尾數(shù)，計(jì)算增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、成活率（SR）、飼料系數(shù)（FCR）。每桶隨機(jī)抽取5 條魚，經(jīng)100 mg/L 的丁香酚輕微麻醉后進(jìn)行尾靜脈取血用于測定各項(xiàng)血液參數(shù)。

生長性能計(jì)算公式如下所示。

式中，N0試驗(yàn)開始魚尾數(shù)；N1試驗(yàn)結(jié)束魚尾數(shù)；W0試驗(yàn)開始魚體重均重；W1試驗(yàn)結(jié)束魚體重均重；d養(yǎng)殖試驗(yàn)天數(shù)；F攝食飼料總量。

1.4.2 血液參數(shù)測定 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）采用紅細(xì)胞稀釋法測定；血紅蛋白濃度（Hb）采用沙力氏比色法測定；血細(xì)胞比容（HCT）采用離心法測定；并根據(jù)以上指標(biāo)計(jì)算平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）以及平均血紅蛋白濃度（MCHC）。

血液參數(shù)計(jì)算公式如下所示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示，采用SPSS 22.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)正態(tài)分布，對于不滿足正態(tài)分布的指標(biāo)采用非參數(shù)檢驗(yàn)來進(jìn)行分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加不同硒含量對黃河鯉魚幼魚生長性能的影響

各試驗(yàn)組黃河鯉魚幼魚的終末體重、增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和成活率見表2。由表2 可以看出，基礎(chǔ)飼料添加不同含量的硒后，各添加組終末體重均高于對照組，且差異均顯著（P＜0.05），其中0.50 mg/kg 組終末體重達(dá)到最高。各添加組增重率均高于對照組，0.50 mg/kg 和1.00 mg/kg 組均顯著高于對照組（P＜0.05），且在0.50 mg/kg 組最高。特定生長率在0.50 mg/kg 組最高，顯著高于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。餌料系數(shù)在0.50 mg/kg 組最低，顯著低于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。飼料中硒含量對成活率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 不同硒含量飼料對黃河鯉魚幼魚的生長性能影響

2.2 飼料中添加不同硒含量對黃河鯉魚幼魚血液參數(shù)的影響

各試驗(yàn)組黃河鯉魚幼魚血液參數(shù)見表3。由表3 可知，紅細(xì)胞數(shù)量與飼料硒水平成正比，各試驗(yàn)組中紅細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組（P＜0.05）；其中1.00 mg/kg 組紅細(xì)胞數(shù)量最高，顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。隨著硒含量的增加，血紅蛋白含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，其中0.50 mg/kg 組的血紅蛋白含量顯著高于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。血細(xì)胞比容在對照組和各試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼料硒水平的增高，MCV 和MCH 水平降低，與飼料中硒含量成反比，其中1.00 mg/kg 組MCV 顯著低于對照組（P＜0.05），而MCH 顯著低于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。MCHC 與飼料硒含量呈正比，在1.00 mg/kg 組達(dá)到最高，與對照組和0.25mg/kg 組差異顯著（P＜0.05）；與0.50 mg/kg 組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同硒含量飼料的黃河鯉魚幼魚的血液指標(biāo)

3 討論

3.1 飼料中添加不同含量的硒對黃河鯉魚幼魚生長性能的影響

硒元素在生物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。研究表明，在魚類飼糧中添加硒可以促進(jìn)魚體生長、降低死亡率、提高機(jī)體免疫力，反之會(huì)減緩魚體生長，增加患病幾率［21，22］；但如果攝入過量的硒，則會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)生長受損或者慢性中毒現(xiàn)象［23］。本研究中飼料中硒含量為0.50 mg/kg 時(shí)，黃河鯉魚幼魚的增重率和特定生長率最高，表明黃河鯉魚幼魚飼料中添加硒的最適量為0.50 mg/kg。該結(jié)果與在鱸魚（0.40～0.63 mg/kg）［24］、中國對蝦（0.44 mg/kg）［25］中的研究結(jié)果相似。Wang 等［15］從最佳生長率考慮測得黑鯛幼魚對硒的需要量為0.86 mg/kg（干飼料）；談楓［26］以最佳生長速率為判定依據(jù)得出中期鱸魚對硒的最適需要量為0.75 mg/kg；張清雯等［27］以增重率為評價(jià)指標(biāo)通過二次曲線模型分析得出條紋鋸鮨對硒的需求量為0.62 mg/kg。不同魚類對硒的需要量有較大差異，原因可能是攝食習(xí)性、生理特點(diǎn)、養(yǎng)殖模式以及飼料加工工藝的差異造成的。此外黃河鯉魚幼魚的增重率和特定生長率隨著飼料中硒含量的增加不斷升高，但當(dāng)硒含量達(dá)到1.00 mg/kg 濃度時(shí)，增重率和特定生長率則不同程度的下降，表明添加1.00 mg/kg 的硒對黃河鯉魚幼魚的生長產(chǎn)生了一定程度的抑制作用，這與金明昌［28］在鯉魚中的研究結(jié)果相似。Hilton 等［29］測得長期飼喂含3 mg/kg 硒干飼料會(huì)對虹鱒機(jī)體產(chǎn)生毒性，研究發(fā)現(xiàn)飼喂11.4 mg/kg 含硒飼料導(dǎo)致虹鱒腎臟不溶性鈣鹽沉積從而損傷腎臟組織。過高濃度的硒不但不會(huì)消除自由基，反而以產(chǎn)生自由基為主，同時(shí)高水平硒與硫化合物有較強(qiáng)的親和力，兩者形成硒-硫復(fù)合物在生物機(jī)體發(fā)揮毒性，可能是高水平硒飼糧使生產(chǎn)性能減弱的原因。

動(dòng)物的生長發(fā)育過程受多種影響因素調(diào)控，其中神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)合成和分泌的生物活性物質(zhì)在該過程中起核心作用。研究表明，硒作為5′-脫碘酶的組成成分，使低活性的四碘甲腺原氨酸轉(zhuǎn)化為高活性的三碘甲腺原氨酸，促進(jìn)生長激素的合成和分泌，從而加快動(dòng)物的生長和蛋白質(zhì)合成［30］；同時(shí)硒是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的重要組成成分，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，從而實(shí)現(xiàn)促生長作用［31］。Dawood等［32］研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加1 mg/kg 納米硒顆粒顯著促進(jìn)紅鯛的生長，增重率顯著高于對照組；楊原志等［33］研究分別以亞硒酸鈉和蛋氨酸硒為飼料硒源，當(dāng)飼料硒水平為1.46 mg/kg 和1.29 mg/kg 時(shí)極顯著提高了軍曹魚的增重率和特定生長率；胡俊茹等［34］研究表明投喂含硒飼料可以顯著提高黃顙魚幼魚的飼料轉(zhuǎn)化率，添加量為0.23 mg/kg 時(shí)顯著提高黃顙魚幼魚的增重率，降低餌料系數(shù)。結(jié)果表明，當(dāng)飼料中的硒添加量為0.50 mg/kg 時(shí)，黃河鯉魚幼魚的增重率和特定生長率處于最高水平，餌料系數(shù)顯著降低，可能與硒能夠促進(jìn)生長激素的合成及分泌以及提高機(jī)體免疫能力有關(guān)。結(jié)果表明，當(dāng)飼料中的硒添加量為0.50 mg/kg 時(shí)，黃河鯉魚幼魚的增重率和特定生長率處于最高水平，餌料系數(shù)顯著降低，這可能與硒能夠促進(jìn)生長激素的合成及分泌以及提高機(jī)體免疫能力有關(guān)。

3.2 飼料中添加不同含量的硒對黃河鯉魚幼魚血液參數(shù)的影響

血液參數(shù)可用來評估魚類的健康生理狀況［35，36］。魚類血液與機(jī)體代謝、營養(yǎng)和疾病反應(yīng)有著密切的關(guān)系，當(dāng)機(jī)體受到來自外界因子的影響產(chǎn)生生理機(jī)能差異時(shí)，勢必會(huì)在血液參數(shù)中反映出來，因此血液學(xué)常用來評估魚類健康狀況、營養(yǎng)以及對環(huán)境的適應(yīng)等指標(biāo)。隨日糧硒水平的升高，RBC 數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，Hb 含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；RBC 數(shù)量和Hb 含量可以提高血氧承載能力，對照組中RBC 數(shù)量顯著低于0.50 mg/kg 和1.00 mg/kg組（P＜0.05）。郝小鳳［37］在大鱗副泥鰍中發(fā)現(xiàn)隨飼料硒水平的升高，血液Hb 含量和RBC 數(shù)量呈先升高后降低的趨勢，在0.50 mg/kg 組達(dá)到最高水平；蘇傳福［38］指出日糧硒對草魚血液RBC 數(shù)量和Hb 含量有顯著影響，呈現(xiàn)隨硒含量先升高后降低的趨勢，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明飼料中添加硒間接促進(jìn)了黃河鯉魚幼魚血液運(yùn)輸氧氣的能力。硒是參與抗氧化酶系中谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分，表明硒缺乏使血細(xì)胞膜表面的不飽和脂肪酸受到體內(nèi)自由基攻擊，激發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成血細(xì)胞膜損傷，發(fā)生溶血，導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量減少。此外1.00 mg/kg 組中Hb 含量低于對照組，這可能反映出此時(shí)的濃度對黃河鯉魚幼魚產(chǎn)生了低毒效應(yīng)，機(jī)體為應(yīng)對不良反應(yīng)產(chǎn)生了更多的紅細(xì)胞，以此維持正常生理機(jī)能所必需的氧氣，這與硒對異育銀鯽［39］血液生化指標(biāo)的結(jié)果相似。該研究中日糧硒水平對血液Hct 沒有顯著影響（P＞0.05），Rider 等［40］在虹鱒魚飼糧中分別加入亞硒酸鈉和酵母硒發(fā)現(xiàn)不同硒水平對虹鱒血液中的Hct 沒有顯著影響，與本研究結(jié)果一致。但也有部分研究證實(shí)日糧硒水平可以提高紅細(xì)胞比容。Ilham 等［41］在美洲肺魚中的高豆粕飼料中添加有機(jī)硒發(fā)現(xiàn)硒水平為2、3、4 mg/kg 組Hct 顯著高于對照組（P＜0.05）；Bell 等［42］在虹鱒魚的研究中發(fā)現(xiàn)硒和維生素E 對紅細(xì)胞比容有顯著交互作用，在缺乏這兩種營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，虹鱒魚的紅細(xì)胞比容顯著減少。這可能與硒添加水平和魚品種有關(guān)。飼料中添加硒導(dǎo)致MCV 和MCH 有不同程度的降低，其中1.00 mg/kg 與對照組的差異顯著（P＜0.05），表明隨著飼糧硒水平的不斷升高，紅細(xì)胞體積也不斷減小，從而改變單位體積中紅細(xì)胞數(shù)量，使血液與氧氣的總接觸面積增加，增強(qiáng)血液代謝，加快血細(xì)胞的氣體交換，進(jìn)而間接促進(jìn)黃河鯉魚幼魚的生理代謝，健康指數(shù)增加。血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧的特殊蛋白質(zhì)，MCHC 水平隨飼料硒含量增加而不斷升高，直接增加了單位內(nèi)氧氣的運(yùn)輸量，有利于黃河鯉魚幼魚的生長。

4 結(jié)論

飼料中添加亞硒酸鈉能提高黃河鯉魚幼魚的增重率、特定生長率，降低餌料系數(shù)；增加單位體積內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量，使黃河鯉魚幼魚血液攜氧能力提高，代謝能力增強(qiáng)，代謝指數(shù)增加。黃河鯉魚幼魚飼料中亞硒酸鈉最適添加量為0.50 mg/kg。