范琦琦，李芝奇，陳美琳，魏 靜，于啊香，宋若蘭，董 英，姚鑒玲，折改梅，趙崇軍

·藥理與臨床·

基于斑馬魚模型的吳茱萸提取物肝毒性評價

范琦琦，李芝奇，陳美琳，魏 靜，于啊香，宋若蘭，董 英，姚鑒玲，折改梅*，趙崇軍*

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室，北京 102488

基于斑馬魚模型，通過生化指標(biāo)、病理組織學(xué)、體內(nèi)細胞凋亡檢測和分子生物學(xué)技術(shù)整合評價模式對吳茱萸提取物肝毒性進行綜合評價。給予亞致死劑量（＜LC10）下的吳茱萸提取物24 h，測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartic aminotransaminase，AST）活性，觀察斑馬魚肝臟病理組織，吖啶橙（aeridine orange，AO）染色觀察肝臟細胞凋亡狀態(tài)，結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法Western blotting、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和代謝組學(xué)初步探究吳茱萸毒性機制。給予吳茱萸提取物后，斑馬魚AST、ALT活性均顯著升高，肝臟病理組織蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色及AO染色觀察提示斑馬魚肝臟受損，細胞凋亡增加，相關(guān)凋亡基因和蛋白表達水平顯著上升，非靶向代謝組學(xué)結(jié)果表明吳茱萸提取物影響斑馬魚氨基酸代謝。通過斑馬魚模型整合評價方法從多水平、多角度、多指標(biāo)實現(xiàn)吳茱萸誘導(dǎo)肝毒性的綜合評價，為斑馬魚在中藥肝毒性評價的適用性提供了支撐。

吳茱萸；肝毒性；整合評價；斑馬魚；代謝組學(xué)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth.、石虎(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang 或疏毛吳茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang 的干燥近成熟果實[1]，有小毒?，F(xiàn)代藥理研究表明，吳茱萸具有肝臟毒性，給予小鼠60 g/kg以上劑量的吳茱萸水煎劑可引起肝臟指標(biāo)異常，血清中轉(zhuǎn)氨酶活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平顯著升高，組織病理學(xué)觀察肝臟可見明顯的肝組織腫脹和脂肪變性[2]，大鼠單次給予吳茱萸70%乙醇提取物生藥量60 g/kg，可引起血清中轉(zhuǎn)氨酶活性和肝臟指數(shù)增加，組織病理學(xué)觀察到大鼠中央靜脈周圍肝細胞變性、壞死[3]。以上均提示吳茱萸提取物單次大劑量給藥可造成肝損傷。此外，也有吳茱萸與其他藥物配伍應(yīng)用造成肝毒性的報道[4]。目前，用于研究肝毒性中藥的動物模型主要是大鼠和小鼠，成本高、周期長，難以進行規(guī)模化篩選，而斑馬魚模型兼具體外細胞高通量優(yōu)勢以及體內(nèi)動物模型的生物復(fù)雜性特點，在篩選和評價藥物毒性方面具有獨特的優(yōu)勢。本研究以肝毒性中藥吳茱萸為例，結(jié)合表型、病理生化指標(biāo)、分子生物學(xué)水平及代謝組學(xué)綜合評價斑馬魚作為高通量動物模型用于快速篩選肝毒性藥物的適用性。

1 儀器與材料

1.1 試劑與藥材

本實驗中質(zhì)譜甲醇（批號L-21104）和正己烷（批號L-18419）購自Thermo Fisher公司；MSTFA衍生化制劑（批號24589-78-4）購自Merck公司；實驗用超純水（18.2M）由裝備有液質(zhì)聯(lián)用的過濾專用頭（LC-MS Pak）的Millipore Reference 超純水系統(tǒng)（美國Billerica公司）制備；TRIzol Universal Reagent（批號S7130）、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（批號Lot#R7026）均購自于北京天根生化科技有限公司；TransStart Top Green qPCR SuperMix（批號Lot#O11120）購自于全式金生物技術(shù)有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartic aminotransaminase，AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒均購自于南京建成科技有限公司，批號分別為20201029、20201103；苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、10% SDS溶液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（Lot:204M040611）、10×TBST緩沖液、5×蛋白上樣緩沖液、10×麗春紅染液、山羊抗兔IgG（H＋L）- Alexa. Fluor（DE0635）均購自于拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Caspase-3抗體（ab13847，Abcam公司）；CHCl3（批號20181107）、NaCl（批號20201201）、K2HPO4（批號20200320）、KH2PO4（批號20130117）、NaHCO3（批號20200818），均為分析純，購于北京化工廠；MgSO4（批號Z13O11Y127224）、CaCl2（批號Z05N11Y130022）均為分析純，購于上海源葉生物科技有限公司。吳茱萸藥材購于安國圣山藥業(yè)有限公司由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth. 的干燥近成熟果實。

1.2 儀器

氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-TOF/MS，美國LECO Corp.公司）；V16體式熒光顯微鏡（卡爾·蔡司公司股份公司）；Stemi508體式顯微鏡（卡爾·蔡司公司股份公司）；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（gene5，Gene公司）；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；GTR10-2型低速冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）；WH-90A微型漩渦混懸器（上海振榮科學(xué)儀器有限公司）；ChemiDoc MP熒光成像系統(tǒng)、CFX96 real-time PCR System（Bio-Rad公司）；全自動組織勻漿器（Next Advance，Inc.，Averill Park公司）；自動進樣玻璃瓶（美國Agilent Technologies公司）；Scientz-10N型超低溫冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 實驗動物

正常野生AB型斑馬魚，魚齡約3個月，雌雄各半，親本購于中國科學(xué)院水生生物研究所，由本實驗室飼養(yǎng)繁殖。

2 方法

2.1 吳茱萸提取物“量-毒”曲線的建立

2.1.1 吳茱萸提取物的制備 吳茱萸藥材粉碎后過40目篩，稱取適量粉末，加入10倍量蒸餾水提取2次，每次提取2 h，濾過，濾液合并后5000 r/min離心30 min，取上清液，濃縮，真空干燥，得到吳茱萸提取物粉末，并按照《中國藥典》2020年版方法進行質(zhì)控。取用時，稱取一定量的吳茱萸提取物粉末進行研磨，溶于50 mL胚胎培養(yǎng)水中，超聲30 min。

2.1.2 吳茱萸提取物“量-毒”曲線的建立 隨機選取受精后4 d（4 days after fertilization，4 dpf）的斑馬魚幼魚置于12孔板中，每孔20尾，分別暴露于一系列不同濃度的吳茱萸提取物中，以斑馬魚培養(yǎng)水為對照組，每組設(shè)置4孔重復(fù)。暴露過程于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行，每隔8 h統(tǒng)計各組的斑馬魚死亡數(shù)量并及時移除死亡幼魚。24 h后統(tǒng)計每組的死亡率，繪制吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚的“量-毒”曲線，計算10%致死濃度（LC10）。

2.2 肝功指標(biāo)評價

隨機選取4 dpf斑馬魚幼魚暴露在亞致死濃度（＜LC10，600、700、800 μg/mL）下的吳茱萸提取物溶液中24 h，同時設(shè)置對照組（斑馬魚培養(yǎng)水），到達暴露終點時，用斑馬魚培養(yǎng)水清洗3次后每組收集80尾幼魚樣本，于PBS（1∶9）中勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書操作，測定ALT和AST的活性。

2.3 肝臟病理組織學(xué)評價

隨機選取4 dpf斑馬魚幼魚暴露在亞致死濃度（840 μg/mL）下的吳茱萸提取物溶液中24 h，同時設(shè)置對照組（斑馬魚培養(yǎng)水），到達暴露終點時，將斑馬魚樣本轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛緩沖液中，室溫保存。然后在乙醇中逐步脫水，石蠟包埋，切成4～5 μm的薄片后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于顯微鏡下觀察吳茱萸提取物暴露處理后的斑馬魚肝臟組織病理狀態(tài)。

2.4 體內(nèi)細胞凋亡評價

隨機選取4 dpf斑馬魚幼魚暴露在亞致死濃度（840 μg/mL）下的吳茱萸提取物溶液中24 h，同時設(shè)置對照組（斑馬魚培養(yǎng)水），到達暴露終點時，移除吳茱萸提取物藥液，快速加入5 μg/mL AO 2 mL，避光染色20 min后，收集斑馬魚樣本，固定，在熒光顯微鏡下觀察和拍照，評價吳茱萸提取物對肝細胞凋亡的影響。

2.5 RT-qPCR檢測細胞凋亡因子表達水平

隨機選取4 dpf斑馬魚幼魚暴露在亞致死濃度（＜LC10，600、700、800 μg/mL）下的吳茱萸提取物溶液中24 h，同時設(shè)置對照組（斑馬魚培養(yǎng)水），到達暴露終點時，以每組80尾斑馬魚進行取樣，TRIZOL法提取斑馬魚總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒中的操作說明分別進行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng)，采用2?ΔΔCt法計算半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（）、和的基因轉(zhuǎn)錄水平。引物序列見表1。

表1 細胞凋亡因子引物序列

Table 1 Primer sequence of apoptosis factor

基因前引 (5’→3’)后引 (5’→3’) β-actinGGCTGTGCTGTCCCTGTATGGGCGTAACCCTCGTAGAT Caspase-3TCAGGCTTGTCGAGGAACCTGCCATACTTTGTCATCATTT Caspase-8AAGACCTGATTCTGCGACTGTAGGCTGAGACACCTTTACG Caspase-9TTCATCGCCCTCCTGTCCTGGCATCCATCTTGTAGC

2.6 Western blotting測定凋亡蛋白Caspase-3表達水平

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑，蛋白抽提開始前加入適量0.1 mol/L PMSF母液以保證最終的PMSF濃度為1 mmol/L。準(zhǔn)確稱取定量的樣本組織（同“2.5”項）并置于冰水混合物中，按照1∶9比例加入裂解液，電動組織勻漿器進行勻漿。孵育20 min后，4 ℃、3000 r/min離心20 min，取上清。按照BCA法進行蛋白定量，通過RIPA調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性5 min。取20 μg總蛋白上樣進行凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，3% BSA-TBST封閉30 min。3% BSA-TBST分別與Caspase-3、β-actin抗體以1∶50比例進行稀釋，4 ℃孵育過夜；5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗山羊抗兔IgG（H＋L）HRP（1∶10 000），室溫孵育40 min，添加ECL后反應(yīng)3～5 min，依次曝光、顯影、定影。

2.7 數(shù)據(jù)處理及分析

2.8 GC-TOF/MS代謝組學(xué)評價

2.8.1 樣品處理 隨機選取4 dpf斑馬魚幼魚暴露在亞致死濃度（840 μg/mL）下的吳茱萸提取物溶液中24 h作為實驗組，設(shè)置對照組（斑馬魚培養(yǎng)水）。到達暴露終點時，精確稱量25 mg待測斑馬魚樣品，研磨混勻后加入80 μL預(yù)冷的50%甲醇溶液，置于全自動組織勻漿器進行勻漿。勻漿后4 ℃、13 500 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液。在殘余蛋白沉淀物中精密加入200 μL預(yù)冷的甲醇-氯仿（3∶1）混合溶液再次勻漿。合并2部分上清液，再次離心20 min。精密移取200 μL上清液置于真空離心濃縮儀中除去溶劑，最后將樣品凍干；恢復(fù)室溫后，充入高純度氮氣保護，自動壓蓋保存；通過加樣臂自動加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，30 ℃條件下孵育2 h；加入50 μL MSTFA于37.5 ℃孵育1 h。

2.8.2 GC-TOF/MS檢測條件 采用GC-TOF-MS進行非靶向代謝組學(xué)檢測。Rxi-5MS氣相色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序（80 ℃保持2 min后以12 ℃/min升至300 ℃，保持4.5 min，后以40 ℃/min升至320 ℃并保持1 min）；前進樣口溫度270 ℃；進樣量1.0 μL；傳輸接口溫度270 ℃；離子源溫度220 ℃；電離電壓?70 ℃；掃描速率為25每秒光譜；質(zhì)量范圍/50～550。

2.8.3 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計 由GC-TOF/MS產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)通過Chroma-TOF軟件自動輸出到非靶向代謝組學(xué)軟件XploreMET中，進行基線平滑和矯正、去卷積、原始色譜峰信號提取和對齊、保留指數(shù)矯正、代謝物鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理。采用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）統(tǒng)計方法區(qū)分對照組和實驗組組間代謝譜差異。

2.8.4 差異代謝物篩選及代謝通路富集分析 采用hypergeometric算法將代謝物進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集，以變量投影重要性指標(biāo)（variable importance in projection，VIP）＞1，＜0.05的代謝物作為差異代謝物進行通路富集分析，加強代謝物的貢獻，尋找關(guān)鍵代謝網(wǎng)絡(luò)。

3 結(jié)果

3.1 “量-毒”曲線評價

通過SPSS 17.0軟件繪制吳茱萸提取物對斑馬魚的“量-毒”曲線，如圖1所示。經(jīng)計算，吳茱萸提取物L(fēng)C10為846.12 μg/mL。

3.2 斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)評價

觀察斑馬魚病理切片可知，吳茱萸提取物對斑馬魚肝臟造成明顯損傷，其他臟器未見異常。表型圖如圖2-B所示，對照組斑馬魚肝臟組織、細胞完整，細胞質(zhì)均勻，細胞核呈規(guī)則圓形，而經(jīng)吳茱萸提取物暴露處理后的斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞質(zhì)減少，排列松散，空泡化嚴(yán)重。

圖1 吳茱萸提取物“死亡率-濃度”效應(yīng)曲線

3.3 斑馬魚體內(nèi)細胞凋亡評價

AO具有膜通透性，使細胞核中DNA和RNA著色。在凋亡細胞中，染色質(zhì)固縮或斷裂形成凋亡小體，經(jīng)AO染色后，熒光顯微鏡下呈綠色熒光[5]。染色結(jié)果如圖2-C所示，與對照組相比，吳茱萸提取物組斑馬魚肝臟區(qū)域熒光明顯增強，細胞凋亡增多，表明吳茱萸提取物能夠誘導(dǎo)斑馬魚肝臟損傷，顯著引起肝細胞凋亡（圖2-C），其他臟器未見明顯的細胞凋亡。

3.4 斑馬魚肝臟生化指標(biāo)評價

ALT和AST活性是傳統(tǒng)評價肝毒性的標(biāo)志物，且ALT被視為肝臟損傷臨床生化檢測的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[6]，本實驗以ALT、AST為指標(biāo)對斑馬魚幼魚整體轉(zhuǎn)氨酶水平進行評價。如圖2-A所示，與對照組相比，經(jīng)吳茱萸提取物暴露處理24 h后，各劑量組斑馬魚幼魚整體AST和ALT活性均顯著升高（＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴性，且ALT指標(biāo)檢測比AST更加敏感，與現(xiàn)有研究報道一致[7]。

3.5 RT-qPCR測定斑馬魚凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

本實驗通過評價凋亡相關(guān)基因、和的轉(zhuǎn)錄水平以考察吳茱萸提取物引起的肝細胞凋亡是否與Caspase途徑有關(guān)。如圖3-A所示，經(jīng)吳茱萸提取物處理后，、和基因表達水平均呈現(xiàn)顯著上升趨勢（＜0.01）。

3.6 Western blotting檢測斑馬魚Caspase-3蛋白表達水平

如圖3-B所示，與對照組相比，經(jīng)吳茱萸提取物處理后，各劑量組斑馬魚Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）。

3.7 代謝組學(xué)評價

將吳茱萸提取物組與對照組數(shù)據(jù)進行有監(jiān)督的OPLS-DA分析，2組區(qū)分明顯，表明代謝輪廓存在差異（圖4-A.a），隨機置換測試（＝100）結(jié)果見圖4-A.b，以Q2＜0為評價標(biāo)準(zhǔn)，證明該評價模型具有良好的可信性和預(yù)測性。以VIP≥1和＜0.05為評判標(biāo)準(zhǔn)來尋找吳茱萸提取物組和對照組之間的差異代謝物（圖4-A.c），基于共篩選得到的差異代謝物，通過KEGG代謝通路富集分析來尋找吳茱萸的關(guān)鍵代謝通路（圖4-B），并將不同代謝通路中所涉及到的差異代謝物分別歸納整理（表2）。

4 討論

斑馬魚自身肝臟具有的一些優(yōu)勢特征，促使斑馬魚模型在肝毒性藥物的高通量篩選中脫穎而出。斑馬魚的肝臟發(fā)育較快，同哺乳動物模型相比，具有高度遺傳保守性，在肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動物具有相似性[8-10]，因此，斑馬魚替代傳統(tǒng)哺乳動物模型廣泛用于藥物誘導(dǎo)肝損傷的研究。此外，斑馬魚胚胎具有光學(xué)透明性的特點，相關(guān)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展也促進了斑馬魚在藥物肝毒性高通量篩選中的應(yīng)用[11-12]。斑馬魚幼魚在確定肝毒性方面表現(xiàn)出了能與傳統(tǒng)模型相媲美的能力，而且能夠預(yù)先篩選具有潛在肝毒性效果的化合物[13-14]。

本實驗基于斑馬魚模型，從病理組織學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等多方面技術(shù)整合評價吳茱萸提取物的肝毒性，發(fā)現(xiàn)吳茱萸毒性大小與暴露濃度呈現(xiàn)明顯的劑量正相關(guān)性。通過建立吳茱萸提取物“量-毒”曲線，明確毒性劑量，并控制在亞致死量暴露條件下，通過病理組織切片和整體AO染色觀察到毒性表型。結(jié)果表明，吳茱萸提取物對斑馬魚肝臟造成明顯肝損傷，未見其他臟器損傷。與對照組相比，經(jīng)吳茱萸提取物暴露處理后的斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域的熒光強度增強，提示斑馬魚幼魚的肝臟組織出現(xiàn)明顯的細胞凋亡；病理組織結(jié)果同樣表明吳茱萸提取物暴露處理能夠破壞斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)，造成組織結(jié)構(gòu)松散，肝細胞空泡化。同時評價了AST和ALT肝功酶活性，結(jié)果表明吳茱萸提取物處理能使斑馬魚整體肝功酶活性顯著增加。作為肝毒性評價的黃金標(biāo)準(zhǔn)，ALT和AST通常在肝臟中蓄積，而在血液中的水平較低。本實驗中吳茱萸提取物處理仍會顯著增加斑馬魚幼魚整體的肝功酶活性，因此，即使存在不同組織干擾的情況下，斑馬魚幼魚的整體肝功酶評價仍可以作為斑馬魚幼魚肝毒性評價的通用方法。

與對照組比較：**P＜0.01 A-RT-qPCR評價吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚整體Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達的影響 B-Western blotting評價吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚整體Caspase-3表達水平的影響 M-marker

A-吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚整體代謝輪廓和差異代謝物的影響[a-對照組和吳茱萸提取物組OPLS-DA，b-OPLS-DA模型隨機置換測試（n＝100），c-差異代謝物分析] B-吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚整體代謝途徑的影響

表2 差異代謝途徑及相關(guān)的差異代謝物(吳茱萸提取物組vs對照組)

Table 2 Differential metabolic pathways and related differential metabolites between Euodiae Fructus extract group and control group

代謝通路名稱P值呈上升趨勢的代謝物（與對照組相比）呈下降趨勢的代謝物（與對照組相比） 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（alanine, aspartate and glutamate metabolism）5.19×10?3富馬酸、L-谷氨酸檸檬酸、L-天冬酰胺、N-乙酰-L-天門冬氨酸 泛酸和輔酶a的生物合成（pantothenate and CoA biosynthesis）6.83×10?3β-丙氨酸、泛酸、尿嘧啶、L-半胱氨酸 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（glycine, serine and threonine metabolism）0.010 7肌酸、二甲基甘氨酸、甘油酸、肌氨酸、L-半胱氨酸 精氨酸生物合成（arginine biosynthesis）0.018 5富馬酸、L-谷氨酸、尿素 半乳糖代謝（galactose metabolism）0.024 0肌醇D-葡萄糖、D-半乳糖、α-乳糖 乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）0.038 0甘油酸、L-谷氨酸檸檬酸、果酸 ?；撬?、亞磺酸代謝（taurine and hypotaurine metabolism）0.041 3L-半胱氨酸亞牛磺酸 嘌呤代謝（purine metabolism）0.058 0鳥嘌呤、鳥苷、黃嘌呤、尿素尿酸、黃嘌呤核苷 精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）0.072 0鳥嘌呤、L-谷氨酸、腐胺L-脯氨酸 新霉素、卡那霉素和慶大霉素的生物合成（neomycin, kanamycin andgentamicin biosynthesis）0.082 0 D-葡萄糖

細胞凋亡是經(jīng)一系列基因活化及調(diào)控細胞有序的、自主的主動死亡過程，通常由蛋白酶Caspases介導(dǎo)蛋白裂解引起細胞凋亡[15]。Caspase家族蛋白是一種直接誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化解體的蛋白酶系統(tǒng)，內(nèi)源性指向途徑主要在由線粒體介導(dǎo)的細胞色素C中，細胞色素C被釋放后立即與胞質(zhì)中的Caspase-9聯(lián)合形成轉(zhuǎn)化體，啟動Caspase-3在細胞凋亡過程中發(fā)揮調(diào)控作用。高轉(zhuǎn)錄水平的、和是引起細胞凋亡的重要指示。RT-qPCR結(jié)果顯示，斑馬魚幼魚中3個凋亡基因的轉(zhuǎn)錄水平對吳茱萸提取物處理均表現(xiàn)出較強響應(yīng)，呈現(xiàn)顯著的上升趨勢（＜0.01）。Western blotting也進一步驗證了Caspase-3蛋白表達水平顯著上調(diào)（＜0.01），結(jié)合AO染色后觀察到的凋亡細胞增多，表明吳茱萸提取物能夠誘導(dǎo)肝臟細胞凋亡的發(fā)生。

本實驗采用非靶向代謝組技術(shù)探討吳茱萸提取物暴露處理對斑馬魚整體代謝輪廓和代謝途徑的影響，利用OPLS-DA分析方法研究吳茱萸提取物對斑馬魚整體代謝輪廓的影響，確認與肝毒性相關(guān)的重要代謝物。結(jié)果表明吳茱萸提取物組和對照組之間存在顯著的分離趨勢。在此基礎(chǔ)上，通過火山圖來表示吳茱萸提取物組與對照組之間的差異代謝物，最終確定的差異代謝物主要包括氨基酸、碳水化合物及小分子酸、烷烴和含氮分子等小分子化合物，并逐個分析差異代謝物以探討其潛在的毒性機制。最后，通過KEGG途徑分析確認吳茱萸提取物影響的代謝途徑。

氨基酸是斑馬魚主要的能量基質(zhì)，在斑馬魚不同的組織器官，尤其在肝臟中發(fā)揮著重要的生理功能[16]。細胞壞死、肝臟的吸收和內(nèi)源性蛋白的降解都會影響氨基酸水平的變化[17-18]。實驗結(jié)果顯示，吳茱萸提取物處理后，斑馬魚幼魚體內(nèi)的氨基酸代謝水平發(fā)生顯著變化，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，?；撬岷痛闻；撬岽x途徑受到顯著影響。亞?；撬崾桥；撬岷铣傻闹虚g產(chǎn)物，在肝臟中膽汁酸與?；撬峄蚋拾彼峤Y(jié)合，形成膽酸鹽。因此，亞?；撬岷透拾彼岬耐瑫r增加能夠加速膽汁酸的分泌[19]。此外，在本實驗研究中發(fā)現(xiàn)給藥組斑馬魚核酸代謝發(fā)生紊亂，嘌呤作為核苷酸的重要組成部分，是儲存能量的主要生物分子。黃嘌呤作為氧化應(yīng)激損傷的重要生物標(biāo)志物，也是嘌呤代謝的中間產(chǎn)物[20]。黃嘌呤的變化可能與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量降低有關(guān)，并且其最終會在脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成尿酸[21]。尿酸是細胞外液中一種有力的抗氧化物質(zhì)，因此，黃嘌呤的增加和尿酸的降低意味著ATP的產(chǎn)生受到干擾。

本研究結(jié)合斑馬魚幼魚肝功酶活性、肝臟結(jié)構(gòu)和細胞狀態(tài)、凋亡基因和凋亡蛋白的表達水平等多指標(biāo)整體評價了吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚肝臟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸提取物損害斑馬魚幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)，肝功酶表達水平顯著升高，上調(diào)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達水平，誘導(dǎo)肝細胞凋亡，表明斑馬魚模型在中藥肝毒性評價中具有適用性。通過GC-MS比較分析吳茱萸提取物對斑馬魚幼魚整體代謝輪廓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸提取物擾亂斑馬魚幼魚內(nèi)源性代謝物水平，主要影響主要能源物質(zhì)-氨基酸的代謝，最終造成斑馬魚幼魚整體能量代謝紊亂，評價斑馬魚體內(nèi)的氨基酸代謝水平，亦是未來斑馬魚模型評價藥物肝毒性研究可以參考的思路和方法。本研究為支持斑馬魚模型作為一種新的工具來進行肝毒性中藥篩選和預(yù)測提供支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 178.

[2] 祝靚靚, 楊東旭, 劉昕, 等. 吳茱萸果實的肝臟毒性研究及毒性部位初步探索 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(8): 1810-1813.

[3] 李波, 李莉, 趙軍寧, 等. 吳茱萸乙醇提取物對大鼠急性毒性及肝毒性的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2013, 29(2): 120-124.

[4] Cohen S, Heywood E, Pillai A,. Hepatotoxicity associated with the use of white flood, a nutritional supplement [J]., 2012, 36: 45-47.

[5] 孫琦, 范詠梅, 賴柯華, 等. 呋蟲胺對斑馬魚胚胎-幼魚生長發(fā)育及細胞凋亡的影響 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2016, 11(3): 356-364.

[6] Ozer J, Ratner M, Shaw M,. The Current state of serum biomarkers of hepatotoxicity [J]., 2008, 245(3): 194-205.

[7] 侯衍豹, 黃妍, 馬莉, 等. 肝毒性生物標(biāo)志物研究進展 [J]. 藥物評價研究, 2017, 40(12): 1804-1810.

[8] 范琦琦, 李芝奇, 陳美琳, 等. 基于斑馬魚模型的中藥安全性評價研究進展[J]. 中草藥, 2022, 53(1): 278-287.

[9] Zhang Y, Han L W, He Q X,. A rapid assessment for predicting drug-induced hepatotoxicity using zebrafish [J]., 2017, 84: 102-110.

[10] Zhang X Y, Li C X, Gong Z Y. Development of a convenienthepatotoxin assay using a transgenic zebrafish line with liver-specific DsRed expression [J]., 2014, 9(3): e91874.

[11] Driessen M, Kienhuis A S, Pennings J L A,. Exploring the zebrafish embryo as an alternative model for the evaluation of liver toxicity by histopathology and expression profiling [J]., 2013, 87(5): 807-823.

[12] Driessen M, Kienhuis A S, Vitins A P,. Gene expression markers in the zebrafish embryo reflect a hepatotoxic response in animal models and humans [J]., 2014, 230(1): 48-56.

[13] Zhao C J, Li E W, Wang Z Y,. Nux vomica exposure triggered liver injury and metabolic disturbance in zebrafish larvae [J]., 2018, 15(6): 610-628.

[14] Zhao C J, Tian J H, Wang J F,. Zebrafish model for assessing induced organ toxicity bynux-vomica [J]., 2016, 36(4): 522-529.

[15] 張勤麗, 牛僑. 細胞凋亡機制概述 [J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2007, 24(1): 102-107.

[16] Jia S C, Li X Y, Zheng S X,. Amino acids are major energy substrates for tissues of hybrid striped bass and zebrafish [J]., 2017, 49(12): 2053-2063.

[17] Feng B, Wu S M, Lv S,. Metabolic profiling analysis of a-galactosamine/lipopolysaccharide-induced mouse model of fulminant hepatic failure [J]., 2007, 6(6): 2161-2167.

[18] Yu K, Sheng G P, Sheng J F,. A metabonomic investigation on the biochemical perturbation in liver failure patients caused by hepatitis B virus [J]., 2007, 6(7): 2413-2419.

[19] Li C X, Li P, Tan Y M,. Metabolomic characterizations of liver injury caused by acute arsenic toxicity in zebrafish [J]., 2016, 11(3): e0151225.

[20] Ojani R, Alinezhad A, Abedi Z. A highly sensitive electrochemical sensor for simultaneous detection of uric acid, xanthine and hypoxanthine based on poly(l-methionine) modified glassy carbon electrode [J]., 2013, 188: 621-630.

[21] 王文強, 李忠信, 孫萌, 等. 黃嘌呤代謝在腫瘤發(fā)展治療中的研究進展 [J]. 按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué), 2021, 12(18): 95-97.

Hepatotoxicity evaluation ofextract based on zebrafish model

FAN Qi-qi, LI Zhi-qi, CHEN Mei-lin, WEI Jing, YU A-xiang, SONG Ruo-lan, DONG Ying, YAO Jian-ling, SHE Gai-mei, ZHAO Chong-jun

Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Evaluation, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

Based on the zebrafish model, the hepatotoxicity of extract of Wuzhuyu () was comprehensively evaluated by biochemical index evaluation, histopathological evaluation, cell apoptosis, and integrated evaluation model of molecular biology techniques.The sublethal dose (< LC10) ofextract was administered for 24 h, the activity indexes of alanine aminotransferase (ALT) and aspartic aminotransaminase (AST) were determined, the liver pathological tissues of zebrafish were observed, and the apoptosis status of liver cells was observed by aeridine orange (AO) staining. Western blotting (WB), real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and metabolomics were combined to preliminarily explore the toxicity mechanism of, and comprehensively evaluate the liver injury zebrafish model induced byextract.The transaminase level of zebrafish was significantly increased, HE staining and AO staining observation of liver pathological tissue showed that zebrafish liver was damaged, cell apoptosis was increased, and the expression levels of related apoptotic genes and proteins were significantly increased. The results of untargeted metabolomics technique showed that the extract ofaffected amino acid metabolism of zebrafish.Zebrafish model integrated evaluation method was used to achieve comprehensive evaluation of liver toxicity induced byfrom multiple levels, multiple perspectives and multiple indicators, providing support for the applicability of zebrafish in liver toxicity evaluation of traditional Chinese medicine.

; hepatotoxicity; integrated evaluation method; zebrafish; metabolomics

R285

A

0253 - 2670(2022)06 - 1768 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.019

2021-10-11

國家科技重大專項（2018ZX09735005）；北京中醫(yī)藥大學(xué)新教師啟動基金項目（2020-JYB-XJSJJ-009）；北京中醫(yī)藥大學(xué)重點攻關(guān)項目（2020-JYB-ZDGG-035）

范琦琦（1998—），女，碩士，研究方向為中藥安全性評價及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。Tel: 19801139715 E-mail: ki_ki1998@163.com

折改梅（1976—），博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向為中（民族）藥藥效成分和新藥創(chuàng)制研究。Tel: (010)53912129 E-mail: shegaimei@126.com

趙崇軍（1988—），男，助理研究員，主要研究方向為中藥安全性評價及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。Tel: 15301127325 E-mail: 1014256537@qq.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]