王寧寧，魏冠華，張智軍，房建國，Mohammad Umar Farooq，Imtiaz Ahmad Qamar，劉映前，楊志剛*

基于UHPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)的駱駝蓬化學(xué)成分分析及其神經(jīng)保護(hù)活性

王寧寧1，魏冠華1，張智軍1，房建國2，Mohammad Umar Farooq3，Imtiaz Ahmad Qamar3，劉映前1，楊志剛1*

1. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2. 蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 3. 巴基斯坦農(nóng)業(yè)研究中心，巴基斯坦 伊斯蘭堡

基于UHPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)對(duì)駱駝蓬化學(xué)成分進(jìn)行分析，并探討其神經(jīng)保護(hù)活性。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；柱溫35 ℃。質(zhì)譜系統(tǒng)采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式下檢測。利用過氧化氫（H2O2）和6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型，探討駱駝蓬全草和種子的甲醇提取物以及去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿和去甲哈爾滿4種駱駝蓬中主要生物堿的神經(jīng)保護(hù)活性。從駱駝蓬中共鑒別32個(gè)化學(xué)成分，全草中主要含有脫氧鴨嘴花堿、鴨嘴花醇等喹唑酮類生物堿，而種子中主要含有去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿等β-咔啉類生物堿。駱駝蓬全草、種子甲醇提取物和4種生物堿對(duì)LPS刺激誘導(dǎo)BV2細(xì)胞一氧化氮（NO）生成具有一定的抑制活性，并對(duì)H2O2和6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷均具有明顯的保護(hù)作用（＜0.01)。駱駝蓬全草和種子中的生物堿成分存在差異，而且其所含的生物堿類化合物具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，為駱駝蓬的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。

駱駝蓬；UHPLC-QTOF-MS/MS；生物堿；神經(jīng)保護(hù)活性；去氫駱駝蓬堿；駱駝蓬堿；哈爾滿；去甲哈爾滿

駱駝蓬L.為蒺藜科駱駝蓬屬多年生草本植物，其味苦、性溫、有毒，在我國西北干旱地區(qū)廣泛分布[1]。駱駝蓬全草和種子在維吾爾族、哈薩克族、蒙古族、藏族的傳統(tǒng)醫(yī)藥中均可入藥，具有祛風(fēng)止痛、鎮(zhèn)咳平喘、溫身通竅的功效，臨床主治關(guān)節(jié)骨痛、筋脈軟弱、偏癱健忘、神昏頭痛、月經(jīng)不調(diào)等癥[2]。駱駝蓬在巴基斯坦民間傳統(tǒng)醫(yī)藥中也有應(yīng)用，主要用于血液凈化、止痛麻醉、促進(jìn)傷口愈合、糖尿病等[3]。《中國民族藥志》中記載，駱駝蓬能解郁補(bǔ)腦，用于精神郁悶、癱瘓、健忘、癲癇，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病具有一定的治療作用[4]。駱駝蓬全草和種子中主要含有β-咔啉和喹唑酮類生物堿成分，且總生物堿是駱駝蓬子改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的有效部位[5]。張曉雙等[6]研究表明駱駝蓬總堿通過下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抑凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善血管性癡呆性大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，諸多研究表明駱駝蓬屬及其活性生物堿成分對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛藥理作用，包括鎮(zhèn)痛作用、幻覺作用、興奮作用、神經(jīng)保護(hù)作用[7]，以及對(duì)膽堿酯酶和單胺氧化酶具有較強(qiáng)的抑制作用[8]。

LC-MS具有分離性能強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高的優(yōu)勢，且QTOF獲得的高分辨質(zhì)譜信息有助于快速檢索以鑒定代謝物，對(duì)藥用植物中復(fù)雜的微量成分分離分析具有重要的意義[9]。為深入分析駱駝蓬不同部位的生物堿成分和活性差異，本研究首先通過UHPLC- QTOF-MS/MS技術(shù)對(duì)駱駝蓬全草及種子中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別分析，并通過建立過氧化氫（H2O2）和6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞氧化損傷模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型，用駱駝蓬全草和種子的甲醇提取物，及其去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿4種生物堿干預(yù)，探討其神經(jīng)保護(hù)活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 6560離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；無水甲醇（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司，甲酸（質(zhì)譜級(jí)）和乙腈（質(zhì)譜級(jí)），德國Merck公司；去離子水，屈臣氏。UHPLC-QTOF-MS分析對(duì)照品：去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），由蘭州大學(xué)藥學(xué)院劉映前教授提供。

本實(shí)驗(yàn)所用駱駝蓬全草樣品采集于巴基斯坦和中國甘肅，種子樣品采集于中國新疆，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院楊志剛副教授鑒定為蒺藜科駱駝蓬L.的種子及全草，樣品標(biāo)本（202010001）保存于蘭州大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 駱駝蓬的成分分析

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿各1.00 mg，甲醇溶解后配成10 μg/mL的溶液，用0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將駱駝蓬全草和種子粉碎后過50目篩，得到粉末樣品；精密稱取各樣品粉末0.20 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量；超聲處理30 min（功率600 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量；靜置30 min后取上清液1.5 mL，13 000 r/min離心2 min后，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。剩余樣品溶液濾過，濃縮至干，用DMSO配制成相應(yīng)的濃度，用于活性測試樣品。

1.2.3 UHPLC-QTOF-MS/MS條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm），流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）組成。梯度洗脫：0～1 min，3%～5% B；1～3 min，5%～7% B；3～7 min，7%～20% B；7～15 min，20%～40% B；15～22 min，40%～100% B；22～25 min，100% B；25.1～30 min，100% B；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；柱溫35 ℃。

質(zhì)譜系統(tǒng)采用電噴霧離子源（ESI），QTOF操作模式為Auto MS/MS，掃描范圍/50～1700。ESI源參數(shù)：干燥氣（N2）體積流量10 mL/min；干燥氣溫度225 ℃；霧化氣壓力172 kPa；毛細(xì)管電壓3500 V；噴嘴電壓500 V；毛細(xì)管出口電壓400 V；碰撞能10、20、40 eV；正離子模式下檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集與處理 液質(zhì)數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Agilent MassHunter（B.08.00，美國安捷倫公司），Profinder（B.08.00，美國安捷倫公司），Mass Profiler Professional（B.14.9，美國安捷倫公司）。

1.2.5 化合物的鑒定 將Agilent MassHunter軟件采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Profinder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后用Mass Profiler Professional軟件進(jìn)行MS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)每組樣品化合物出現(xiàn)頻率過濾。根據(jù)精確的相對(duì)分子質(zhì)量，計(jì)算化合物可能的元素組成；根據(jù)各成分的相對(duì)保留時(shí)間、二級(jí)特征碎片離子信息、質(zhì)譜裂解規(guī)律，并結(jié)合對(duì)照品指認(rèn)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及Metlin、MassBank、PubChem等數(shù)據(jù)庫比對(duì)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞和PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)液，在含5% CO2和95%空氣的飽和水培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn) 采用MTT法評(píng)估細(xì)胞生存率。分別取對(duì)數(shù)期生長的PC12、BV2細(xì)胞混懸液100 μL接種于96孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每孔中加入10、20 μg/mL濃度的藥物樣品（駱駝蓬全草及種子甲醇提取物浸膏及其4種主要的生物堿：去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿）培養(yǎng)24 h，再加入MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，加入提取緩沖液（由10%十二烷基硫酸鈉、5%異丁醇、0.1% HCl水溶液組成），孵育過夜。甲瓚結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm下測定吸光度（）。

1.3.3 BV2細(xì)胞抗炎活性 通過抑制NO生成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗炎活性。待BV2細(xì)胞貼壁后，每孔加入LPS（1 μg/mL）誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥模型，同時(shí)加入不同濃度的藥物樣品培養(yǎng)24 h。取各孔細(xì)胞上清培養(yǎng)液50 μL置于96孔板中，加入Griess試劑，混勻后靜置。室溫下避光反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定。

1.3.4 PC12細(xì)胞氧化損傷保護(hù)活性 通過檢測細(xì)胞活力變化評(píng)價(jià)藥物對(duì)H2O2、6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用。PC12細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度的藥物樣品培養(yǎng)24 h。更換細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入H2O2（終濃度500 μmol/L)、6-OHDA（終濃度200 μmol/L）建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型。加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔再加入100 μL提取緩沖液，甲瓚結(jié)晶充分溶解后于570 nm波長處測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)成分鑒定

駱駝蓬樣品正離子模式下的總離子色譜圖如圖1，所鑒別的化合物見表1。此外，將Agilent Mass Hunter軟件采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Profinder軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理后以cef格式文件導(dǎo)入MPP軟件進(jìn)行分子特征提?。╩olecular feature extraction，MFE），得出巴基斯坦、中國甘肅和新疆的駱駝蓬樣品中化學(xué)成分?jǐn)?shù)量，結(jié)果見圖2。

a-巴基斯坦和中國甘肅駱駝蓬全草、中國新疆駱駝蓬種子樣品的總離子流圖 b-3個(gè)樣品的總離子流圖對(duì)比分析圖

表1 駱駝蓬中鑒別的主要化學(xué)成分

Table 1 Main compounds in P. harmala

編號(hào)化合物名稱分子式tR/min主要二級(jí)碎片離子（m/z）[M＋H]+（m/z）檢測歸屬理論值實(shí)測值S1S2S3 1駱駝蓬酸C6H11NO30.953128.071 3, 100.076 3, 82.066 2146.081 2146.082 5√√√ 2L-pipecolateC6H11NO21.25084.071 0130.086 3130.086 7√√√ 3indole-3-acetaldehydeC10H9NO2.309132.081 3, 117.057 9160.075 7160.076 0√√√ 4vasicinolC11H12N2O22.838187.087 3, 169.077 7205.097 2205.098 1√√√ 5鴨嘴花堿C11H12N2O3.495161.106 5, 120.044 6, 70.065 9189.102 2189.102 6√√√ 6鴨嘴花醇C11H12N2O3.981171.092 9, 154.066 3, 144.081 3, 118.066 2, 91.055 2189.102 2189.102 6√√√ 7鴨嘴花堿二糖苷C23H32N2O114.491351.154 3, 189.101 5, 171.091 8513.207 9513.208 1√√√ 8鴨嘴花堿糖苷C17H22N2O64.591189.094 3, 171.084 0351.155 1351.157 1√√√ 9pegaharmine IC13H14N2O24.722215.119 5, 188.094 2, 172.097 7, 160.065 1, 144.069 1231.112 6231.112 7√√√ 10luotonin EC19H13N3O24.840301.119 0, 283.104 5, 261.983 4, 231.112 3, 188.090 9316.108 1316.108 5——√ 112-carboxyl-3,4-dihydroquinazolineC9H8N2O24.923149.912 5, 131.060 1, 106.034 6177.065 9177.065 8√√√ 12脫氧鴨嘴花堿C11H12N25.221144.069 7, 118.058 1, 106.067 3, 91.055 1173.107 3173.107 4√√√ 13glycosides vasicinolC18H18N2O36.226205.098 3, 188.073 5, 171.092 1367.151 3367.151√√√ 14脫氧鴨嘴花酮堿C11H10N2O6.301171.090 5, 144.081 0, 118.064 2187.086 6187.086√√√ 15peganumalineFC14H16N2O36.590231.112 1, 188.089 0, 170.079 0261.123 4261.125√√√ 16tetrahydroharmaneC12H14N26.603171.090 3, 144.077 5187.123 0187.124 3√√√ 17鴨嘴花酮堿葡萄糖苷C17H21N2O77.069203.048 3, 185.035 9365.134 3365.134 6√√√ 18鴨嘴花酮堿C11H10N2O27.003185.072 6, 130.066 2203.081 5203.081 8√√√ 19去甲駱駝蓬堿C12H12N2O7.135185.072 6, 160.076 7201.102 2201.103 8√√√ 20二氫路因堿C19H24N2O77.204231.113 7, 215.079 3393.165 6393.166 1√√√ 21路因堿C19H22N2O77.235229.093 3, 214.057 2391.150 0 391.150 6√√√ 22哈爾醇C12H10N2O7.499184.065 9, 181.076 6199.086 6199.087 2√√√ 23去甲哈爾滿C11H8N28.163142.066 1, 115.054 3169.076 0169.075 8√√√ 24去氫駱駝蓬堿氮氧化物C13H12N2O28.342214.074 4, 187.082 6229.097 2229.099 2√√√ 25哈爾滿C12H10N28.824168.078 1, 144.081 4, 115.055 3183.091 7183.092 8√√√ 26dihydroharmaneC12H12N28.874170.084 4, 144.081 5, 130.066 2185.107 3185.108 8——√ 27駱駝蓬堿C13H14N2O9.929200.095 8, 174.092 6215.117 9215.119 4√√√ 28去氫駱駝蓬堿C13H12N2O10.012198.080 2, 170.084 9, 144.080 6213.102 2213.103 6√√√ 293-hydroxylated harmineC13H12N2O210.510215.076 9229.097 2229.098 8√√√ 30脫乙?；橊勁钴誄40H52O2411.072447.133 8, 285.074 8917.292 1917.290 7√√√ 31駱駝蓬苷C42H54O2512.310651.203 5, 447.130 1, 285.076 5959.302 7959.301 9√√√ 32harmalacidineC12H12N2O212.792189.102 2, 162.091 7, 146.063 8, 128.999 5217.097 2217.097 0——√

S1-巴基斯坦全草 S2-中國甘肅全草 S3-中國新疆種子；√表示檢測到該成分 —表示未檢測到該成分

S1-the herbs from Pakistan S2-the herbs from Gansu of China S3-seeds from Xinjiang of China; √detected —not detected

2.1.1 β-咔啉類生物堿結(jié)構(gòu)鑒定 β-咔啉類生物堿是駱駝蓬中最主要的生物堿，包括去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、去甲駱駝蓬堿、哈爾滿、去甲哈爾滿、哈爾醇等[2]。此類結(jié)構(gòu)母核為吡啶并吲哚類，正離子模式下易發(fā)生母核側(cè)鏈CH3（－15）和CO（－28）等中性碎片丟失，母核裂解丟失HCN（－27），丟失C2H4（－28）、丟失NH3（－18）、丟失C2H3N（－41）等[10,16]。

圖2 駱駝蓬全草和種子的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量韋恩圖

化合物23、25、27、28的保留時(shí)間分別為8.163、8.824、9.929、10.012 min，正離子模式下分別產(chǎn)生/為169.075 8、183.092 8、215.119 4、213.102 2 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰，和對(duì)照品的保留時(shí)間、碎片信息及特征峰一致，分別確定為去甲哈爾滿、哈爾滿、駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿。

化合物19、20、21、22和文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]的準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，分別推測為去甲駱駝蓬堿、二氫路因堿、路因堿、哈爾醇。

化合物9的保留時(shí)間為4.722 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/231.112 7 [M＋H]+，推測其分子式為C13H14N2O2，在進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中，可以看到有/為198.925 4（－31，-OCH3）、214.119 5（－17，-OH）、188.098 2（－26，-CN）、172.097 7（－16，-NH2）、144.069 1（－28，-C2H4）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13]，推測其為pegaharmine I。

化合物15的保留時(shí)間為6.590 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/261.123 7 [M＋H]+，推測其分子式為C14H16N2O3，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為231.112 1（－30，-CH2O)、188.089 0（－43，-CH3CO）、170.0790（－18，-NH3）等，結(jié)合文獻(xiàn)獻(xiàn)報(bào)道[14]，推測其為peganumaline F。

化合物16的保留時(shí)間為6.603 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/187.123 1 [M＋H]+，推測其分子式為C12H14N2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為171.090 3（－16，-NH2）、144.077 5（－27，-CH2CH)，118.065 8（－26，C8H8N+）、106.064 4（C7H8N+）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[15]，推測其為tetrahydro norharmane。

化合物24保留時(shí)間為8.342 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/229.098 8 [M＋H]+，推測其分子式為C13H12N2O2。進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為214.074 4（－15，-CH3）、187.082 6（－42，-COCH3）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[16]，推測為去氫駱駝蓬堿氮氧化物。

化合物26的保留時(shí)間為8.874 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/185.108 8 [M＋H]+，推測其分子式為C12H12N2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為170.084 4（－15，-CH3）、143.073 3（－27，-HCN）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[11]，推測其為dihydroharmane。

化合物32的保留時(shí)間為12.792 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/217.097 0 [M＋H]+，推測其分子式為C12H12N2O2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為189.102 2（－28，-CO）、162.091 7（－27，-HCN）、146.063 8（－16，-NH2）、128.999 5（－18，-H2O）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[17]，推測其為harmalacidine。

2.1.2 喹唑酮類生物堿結(jié)構(gòu)鑒定 喹唑酮類生物堿是駱駝蓬全草及種子中另一類重要的生物堿，如鴨嘴花堿（vasicine）、去氧鴨嘴花堿（deoxypeganine）、鴨嘴花堿酮（vasicinone）、去氧鴨嘴花堿酮（deoxyvasicinone）、駱駝寧堿等[2]。

化合物4的保留時(shí)間為2.838 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/205.098 1 [M＋H]+，推測其分子式為C11H12N2O2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為187.084 3（－18，-H2O）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13]，推測其為vasicinol。

化合物5和6保留時(shí)間為3.945 min和3.981 min，正離子模式下首先產(chǎn)生/189.103 0 [M＋H]+準(zhǔn)分子離子峰，推測其分子式為C11H12N2O，對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生/為171.092 9（－18，-H2O），144.081 2（C10H10N+），118.066 2（C8H8N+），91.055 2（C7H7+）等二級(jí)碎片離子，化合物5與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[18]，推測其可能為鴨嘴花堿，而6為鴨嘴花醇。

化合物7的保留時(shí)間為4.491 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/513.208 1 [M＋H]+，推測其分子式為C29H42N2O16，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生丟失1分子葡萄糖/為351.154 3（－162，-Glu）的離子碎片，再丟失1分子葡萄糖/為189.101 5（－162，-Glu）的二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[19]，推測其為二糖苷鴨嘴花堿，但糖具體的連接位置通過質(zhì)譜尚無法確定。

化合物8的保留時(shí)間為4.591 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/351.147 1 [M＋H]+，推測其分子式為C17H22N2O6，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為189.094 3（－162，-Glu），[M＋H－Glu－H2O]+171.084 0（－18，-H2O）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[19]，推測其為鴨嘴花堿糖苷。

化合物10的保留時(shí)間為4.840 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/316.128 5 [M＋H]+，推測其分子式為C19H13N3O2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為301.119 0（－15，-CH3），283.104 5（－18，-H2O），261.983 4（－55，-C4H7），231.112 3（－30，-NH2CH2），188.090 9（－128，-C8H2NO）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[19]，推測其為luotonin E。

化合物11的保留時(shí)間為4.923 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/177.065 8 [M＋H]+，推測其分子式為C9H8N2O2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為149.912 5（－28，-CO），131.060 1（－18，-H2O），106.034 6（－43，-CH3CO）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21]，推測其為2-carboxyl-3,4-dihydroquinazoline。

化合物17的保留時(shí)間為7.069 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/365.111 4 [M＋H]+，推測其分子式C17H21N2O7，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為203.048 3（－162，-Glu），185.035 9（－18，-H2O）等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[19,21]，推測其為鴨嘴花酮堿葡萄糖苷。

化合物12、14、18和文獻(xiàn)報(bào)道[10]的準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，推測為脫氧鴨嘴花堿、脫氧鴨嘴花酮堿、鴨嘴花酮堿。

2.1.3 其他 化合物1和文獻(xiàn)報(bào)道[16]準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，推測其為駱駝蓬酸。

化合物2的保留時(shí)間為1.400 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/130.086 7 [M＋H]+，推測其分子式為C6H11NO2，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為112.063 7（－18，-H2O）二級(jí)碎片離子，通過比對(duì)MassBank數(shù)據(jù)庫，推測其為-pipecolate。

化合物3的保留時(shí)間為2.181 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/160.076 0 [M＋H]+, 推測其分子式為C10H9NO，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為132.081 3（－28，-CO），117.057 9（－15，-CH3）等二級(jí)碎片離子，通過比對(duì)MassBank數(shù)據(jù)庫，推測其為indole-3-acetaldehyde。

化合物13的保留時(shí)間為6.226 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/367.151 0 [M＋H]+，推測其分子式為C18H18N6O3，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為205.098 3（－162，-Glu）碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21]，推測其為glycosides vasicinol。

化合物30的保留時(shí)間為11.072 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/917.295 9 [M＋H]+，推測其分子式為C40H52O24，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為447.133 8，285.074 8二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[16,20]，推測其可能為脫乙?；橊勁钴铡?/p>

化合物31的保留時(shí)間為12.312 min，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰/959.307 7 [M＋H]+，推測其分子式為C42H54O25，進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解中產(chǎn)生/為651.203 5，447.130 1，285.076 5等二級(jí)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[16]，推測其可能為駱駝蓬苷。

從表1和圖1中可以看出，-pipecolate、indole-3-acetaldehyde首次在駱駝蓬中檢測發(fā)現(xiàn)，luotonin E、dihydroharmane、harmalacidine僅在種子中發(fā)現(xiàn)，巴基斯坦和中國產(chǎn)駱駝蓬全草，以及全草和種子間的成分差異較大，鴨嘴花堿、鴨嘴花醇、脫氧鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿、駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、脫乙?；橊勁钴铡Ⅰ橊勁钴盏壬飰A的含量差異較大。此外，從駱駝蓬全草和種子的化學(xué)成分韋恩圖（圖2）中可以看出，巴基斯坦產(chǎn)地和中國甘肅產(chǎn)駱駝蓬全草，以及中國新疆產(chǎn)駱駝蓬種子中的特有的代謝產(chǎn)物數(shù)量分別為183、171和229，而3者共有的代謝物數(shù)量是70，進(jìn)一步說明不同部位、不同產(chǎn)地駱駝蓬成分差異較大。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)3個(gè)產(chǎn)地樣品的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別，已鑒別出的32個(gè)化合物的詳細(xì)信息見表1。中國和巴基斯坦在駱駝蓬全草傳統(tǒng)藥效的應(yīng)用上有差異，不同部位的應(yīng)用也有差異[21]，可能和這些生物堿類有效成分的種類和含量相關(guān)，但仍需要擴(kuò)大樣本量深入探討其藥效物質(zhì)成分-生物活性-作用機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)。

2.2 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 BV2細(xì)胞活性結(jié)果 BV2細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫細(xì)胞，炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[22-23]。BV2細(xì)胞存活率結(jié)果顯示（圖3-a），與空白組相比，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、去甲哈爾滿、種子總浸膏在10、20 μg/mL時(shí)，對(duì)BV2細(xì)胞均無明顯的損傷作用；哈爾滿和全草總浸膏在20 μg/mL時(shí)，BV2細(xì)胞存活率下降，有明顯的損傷作用。LPS作用于BV2細(xì)胞后NO的釋放量會(huì)增加，所有樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞表現(xiàn)出一定的濃度依賴性抑制炎癥相關(guān)因子NO釋放（圖-3b）。

2.2.2 PC12細(xì)胞活性結(jié)果 PC12細(xì)胞常用于研究多巴胺能神經(jīng)元病理和藥理作用，神經(jīng)毒素6-OHDA和H2O2可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡，可用于模擬誘導(dǎo)帕金森病[24]。PC12細(xì)胞MTT活性結(jié)果如圖4-a所示，與空白組相比，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、去甲哈爾滿、種子總浸膏和全草總浸膏在10、20 μg/mL時(shí)，對(duì)PC12細(xì)胞均無明顯的損傷作用，哈爾滿則對(duì)PC12細(xì)胞有較為明顯的損傷作用。不同樣品對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷結(jié)果如圖4-b所示，與H2O2誘導(dǎo)組相比，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、去甲哈爾滿、種子總浸膏和全草總浸膏在20 μg/mL質(zhì)量濃度下，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞均具有明顯保護(hù)作用（＜0.01)。不同樣品對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷結(jié)果如圖4-c所示，與6-OHDA模型組相比，去氫駱駝蓬堿、種子總浸膏和全草總浸膏在20 μg/mL下，對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的氧化損傷的PC12細(xì)胞均具有明顯的保護(hù)作用（＜0.01)。

與空白組比較：*P＜0.05

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與H2O2或6-OHDA誘導(dǎo)組比較：ΔΔP＜0.01

3 討論

本研究采用UHPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)，對(duì)駱駝蓬不同部位全草、種子的甲醇提取物分別進(jìn)行了正、負(fù)離子模式的質(zhì)譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中主要的生物堿類化學(xué)成分在正離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于負(fù)離子模式，篩選的化合物數(shù)量更多，故主要對(duì)正離子模式下采集的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中化合物成分進(jìn)行了分析。從駱駝蓬樣品中共鑒別出32個(gè)化學(xué)成分，巴基斯坦和中國產(chǎn)駱駝蓬全草，以及駱駝蓬全草和種子間的成分存在差異。全草中主要含鴨嘴花醇、脫氧鴨嘴花堿等喹唑酮類生物堿，而種子中主要含有去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿等β-咔啉類生物堿，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]。結(jié)果證實(shí)駱駝蓬提取物及部分β-咔啉類化合物在細(xì)胞水平上具有一定的神經(jīng)保護(hù)活性。但也有研究表明β-咔啉類生物堿對(duì)PC12細(xì)胞能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，且其細(xì)胞毒性作用機(jī)制與2、9位的甲基化具有一定的相關(guān)性[26]。駱駝蓬種子提取物、駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及去甲哈爾滿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子NO的生成具有抑制作用，但是哈爾滿和全草總浸膏在20 μg/mL有一定的細(xì)胞毒性。張曉雙等[27]研究表明駱駝蓬總生物堿可通過上調(diào)海馬突觸素（synaptophysin，syn）、微管相關(guān)蛋白-2（microtubule-associated protein-2，MAP-2）蛋白表達(dá)，并且抑制一氧化氮合酶活性，改善血管癡呆性大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究建立的駱駝蓬化學(xué)成分分析的液質(zhì)方法，有助于了解駱駝蓬不同藥用部位生物活性成分及其神經(jīng)保護(hù)活性。然而，由于種子中2種主要的生物堿駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的含量較高且結(jié)構(gòu)相近, 通過優(yōu)化梯度條件、改變柱溫等而未能將其分開。此外，駱駝蓬具有神經(jīng)保護(hù)活性和神經(jīng)毒性更深層次的機(jī)制仍需通過更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。綜上所述，本研究為駱駝蓬的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一定的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents inbased on UHPLC-QTOF-MS/MS and its neuroprotective activities

WANG Ning-ning1, WEI Guan-hua1, ZHANG Zhi-jun1, FANG Jian-guo2, Mohammad Umar Farooq3, Imtiaz Ahmad Qamar3, LIU Ying-qian1, YANG Zhi-gang1

1. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 3. Pakistan National Agricultural Research Center, Islamabad , Pakistan

To analyze the chemical constituents ofbased on UHPLC-QTOF-MS/MS and explore its possible neuroprotective activities.The chromatographic column was ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1mm, 1.6 μm). The mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution (A) and 0.1% formic acid acetonitrile solution (B), followed by gradient elution. Volume flow was 0.3 mL/min; The injection volume was 2 μL. Column temperature was 35 ℃. The mass spectrometry system used electrospray ion source (ESI), which was detected in positive ion mode. Then, the oxidative damage model induced by H2O2and 6-OHDA in PC12 cells and the BV2 neuroinflammation model induced by LPS were established. The extracts of the aerial parts and seeds of, and the four main alkaloids of harmine, harmaline, harman and norharman, were investigated on their neuroprotective activities.A total of 32 chemical constituents were identified from. The aerial parts mainly contained quinazolone alkaloids, such as peganol and deoxypeganine, while the seeds mainly contained β-carboline alkiods, such as harmine and harmaline. The methanol extracts from the aerial parts, seeds and four main alkaloids showed certain inhibitory activity on NO production in BV2 cells stimulated by LPS. They also had obvious protective effects on PC12 cells induced by H2O2and 6-OHDA (< 0.01).The alkaloid components in the aerial parts and the seeds are quite different, and the alkaloid compounds have certain neuroprotective effects. This study provides some reference for the quality control and the basic research of pharmacological substances of.

L.; UHPLC-QTOF-MS/MS; alkaloids; neuroprotective activity; harmine; harmaline; harman; norharman

R284.1

A

0253 - 2670(2022)06 - 1688 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.011

2021-11-23

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFE0129000）；甘肅省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（18YF1WA115）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20JR5RA311）

王寧寧（1996—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝組學(xué)研究。Tel:18095859563 E-mail: wangnn19@lzu.edu.cn

楊志剛，副教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝組學(xué)研究。Tel: (0931)8915202 E-mail: yangzg@lzu.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]