常馨怡，張文明，尹思倩，陳開山，楊迎香，邢彥宏

（甘肅農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，甘肅 蘭州 730070）

氮是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的元素，目前主要通過施肥和借助生物固氮來增加土壤中的氮素?；试谔岣咦魑锂a(chǎn)量的方面發(fā)揮著重要作用［1］，然而長期大量施用化肥導致土壤酸化板結(jié)，影響土壤健康；此外，氮素通過各種途徑損失破壞生態(tài)環(huán)境［2］，加劇溫室效應［3］。生物固氮可以代替部分化肥氮，減少化肥氮的使用，是促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的綠色、可靠途徑［4-5］。固氮菌不僅給植物提供氮素［6］，還可以活化土壤養(yǎng)分，影響土壤酶［7-8］和重金屬的活化吸收［9］，從而影響植物生長。固氮菌也可作為堆肥添加劑，減少堆肥過程中氮的損失，提高堆肥質(zhì)量［10］，生產(chǎn)固氮菌生物有機肥。

特定生境和樣品有利于分離出具有特定功能和適宜于特殊環(huán)境的微生物菌株［11］。目前，研究者們從植物根系［12］、土壤環(huán)境［13］和水環(huán)境［14］中，分離并鑒定出了大量固氮菌，主要有Azotobacter，Agrobacte?rium，Pseudomonas，Aquaspirillum Dietzia，Azospi?rillum，Dietzia，Neorhizobium，Klebsiella，Bacillus，Enterobacter，Serratia，Arthrobacter，Burkholderia，F(xiàn)ictibacillus，F(xiàn)ictibacillus rigui，Staphylococcusau?reus［11，13，15-18］等。然而，有關堆肥中固氮菌的篩選較少，且篩選于常規(guī)環(huán)境的固氮菌很難適應好氧堆肥的高溫環(huán)境，導致其應用于堆肥的效果受到嚴重影響。因此，本研究從好氧高溫堆肥中分離和鑒定高效嗜熱固氮菌株，并將培養(yǎng)好的固氮菌株回接到堆肥中，以期提高堆肥含氮量和堆肥質(zhì)量，為優(yōu)質(zhì)固氮菌生物有機肥的生產(chǎn)提供高效菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 將雞糞與羊糞充分混勻，含水量調(diào)至（60±1）%，裝箱至箱體的100%（60 cm×60 cm×45 cm 的泡沫箱） ，敞口放置在校園帶彩鋼板頂?shù)氖彝膺M行堆肥，堆肥時間為 2020年9月27日～2020 年10 月18 日。每隔2 d 進行翻堆混勻后取樣。分別從高溫期（第6 天，65 ℃）的樣品和腐熟期（第21天，10 ℃）的樣品篩選嗜熱固氮菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 Ashby 無氮培養(yǎng)基：甘露醇 10 g，H2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO35 g，1 000 mL 去離子水，pH調(diào)至7.2～7.4，固體培養(yǎng)基則再加15～20 g瓊脂。

LB 富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，酵母膏 5 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K2HPO40.2 g，糖類（分別為葡萄糖、乳糖、蔗糖） 10 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4。

葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4。

蛋白胨液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4。

苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基：酵母膏3 g，NaCl 5 g，L-苯丙氨酸1 g，Na2HPO41 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4，分裝試管。

西蒙斯（Simnos）氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：檸檬酸鈉2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，（NH4）2HPO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，1% 麝 香 草 酚 藍 水 溶 液10 mL，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL。

明膠液化培養(yǎng)基：NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，明膠 120 g，去離子水1 000 mL，加熱溶化后pH調(diào)至7.2～7.4。

碳源基礎培養(yǎng)基：酵母膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL（碳源分別為：麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和甘露糖）。

氮源基礎培養(yǎng)基：優(yōu)化后的碳源 5 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL（氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和玉米粉）。

CAS 培養(yǎng)基：蔗糖 2 g，酸水解酪蛋白（SOLARBIO）3 g，磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）5 mL，CaCl2（1 mmol/L） 1 mL，CAS 檢 測 液250 mL，瓊脂 40 g，去離子水 1 000 mL。

無機磷基本培養(yǎng)基：Ca3（PO4）210.0 g，葡萄糖10.0 g，MgSO40.3 g，KCl 0.3 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO40.03 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.0～7.5。

PVK 培養(yǎng)基：葡糖糖 10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，酵 母 粉 0.5 g，MnSO40.002 g，F(xiàn)eSO40.002 g，0.4%溴酚藍溶液 0.6 g/L，瓊脂 18.0 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至7.0～7.2。

有機磷培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，（NH4）2SO40.2 g，MgCl25.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.1 g，植酸鈣2.0 g，去離子水 1 000 mL。

1.2 固氮菌的分離、純化與生理生化鑒定

1.2.1 固氮菌的分離和純化 稱取5 g樣品，用無菌水制成10-1、10-3、10-5、10-7和10-9的菌懸液后均勻的涂布于Ashby無氮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7 d后，選取長勢好的菌株分別接種到新鮮的無氮培養(yǎng)基上，并連續(xù)進行4～5次的劃線純化，直至出現(xiàn)單菌落，繼續(xù)純化。將純化好的菌株于4 ℃斜面保存［19］。

1.2.2 菌株形態(tài)和生理生化鑒定 將保存的菌株接種于LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落形態(tài)（包括形狀、顏色、表面干濕情況），并進行記錄。將菌株進行革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察革蘭氏染色的結(jié)果等［20］。通過糖類發(fā)酵試驗、乙酰甲基甲醇試驗（Voges-Prokauer 試驗）、甲基紅試驗（Methyl red 試驗）、吲哚試驗、苯丙氨酸脫氨酶測定、檸檬酸鹽利用試驗以及明膠液化試驗［15］，結(jié)合Bergey細菌手冊［21］初步鑒定分離的菌株。

1.3 菌株固氮能力的測定

菌株固氮能力的測定參考改進的堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法［22］。將菌株在Ashby無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，離心后取1 mL上清液置于比色管中，用無氨水定容至10 mL，加入堿性K2S2O4（經(jīng)重結(jié)晶得到）溶液后于121 ℃下消解45 min，冷卻后加入1 mL 10% HCl 溶液，用無氨水定容至25 mL，分別在波長220 nm 和275 nm 處測吸光度。以10 mL 無氨水代替樣品溶液作為空白，標準曲線使用 KNO3標準液測定。依據(jù)下式結(jié)合標準曲線計算固氮量：

式中：As220和As275表示樣品溶液分別在波長220 nm和275 nm 下的吸光度；Ab220和Ab275分別表示空白溶液在波長220 nm和275 nm處的吸光度。Ar表示樣品溶液校正吸光度與空白溶液校正吸光度的差。

1.4 菌株最適生長條件和生長曲線的測定

固氮菌最適生長條件測定參考賈輝等［23］的方法，包括最適溫度、pH、鹽濃度和碳氮源的測定。生長曲線的測定參考Omotoyinbo等［24］的方法。

1.5 菌株功能性的測定

1.5.1 固氮菌產(chǎn)IAA 能力測定 參考Glickmann等［25］的方法，采用Salkowski比色法測定菌株產(chǎn)IAA的能力。將細菌在含有2.45 mmol/L L-色氨酸的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，離心后取1 mL 上清液，加入2 mL Salkowski 試劑，室溫暗處顯色30 min 后，于530 nm 處測吸光度。用3-IAA 標準品制作標準曲線，方程為：y=0.112 9x-0.019 4，R2=0.999 1。

1.5.2 產(chǎn)鐵載體能力測定 參考Schwyn 等［26］的方法。將菌株接種到CAS液體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)3 d，若培養(yǎng)基變?yōu)槌壬?，則表示具有產(chǎn)鐵載體的能力。

1.5.3 無機磷利用能力測定 將菌株在PVK培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)3 d 后，劃線部分呈藍色，則表示該種菌可以降解無機磷。將初篩的菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d 后取200 mL 菌懸液接種于50 mL 無機磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，離心后取上清液1.25 mL于比色管中，用鉬銻抗比色法［27］測定上清液磷含量。用標準磷溶液制作標準曲線，方程為：y=0.694 5x+0.016 8，R2=0.999 5。

1.5.4 有機磷降解能力測定 參考王歡等［28］的方法，將菌株點布于有機磷固體培養(yǎng)基上，若有解磷圈出現(xiàn)，則說明該種細菌具有降解有機磷的能力。記錄解磷圈直徑（HD）和菌落直徑（CD），并計算HD/CD。

1.6 菌株分子鑒定

將分離出來的 2 株細菌分別接種于瓊脂平板上，于37 ℃，含5% CO2的大氣中培養(yǎng)后，放入37 ℃的液體培養(yǎng)基中攪拌。根據(jù)制造商的說明，使用細菌DNA 試劑盒（OMEGA）從細胞顆粒中分離出基因組DNA 樣本，隨后對純化的DNA 樣本進行質(zhì)量控制。使用TBS-380 熒光計（特納生物系統(tǒng)公司，加利福尼亞州桑尼維爾）對基因組DNA 進行定量。利用高質(zhì)量的DNA 樣本（D260/280=1.8～2.0，>6 μg）構(gòu)建片段文庫。測序工作由上海Biozeron生物技術有限公司（中國上海）進行。對每個菌株的Illumina對末端測序，用至少1 μg基因組DNA 進行測序文庫的構(gòu)建。按照Illumina的標準基因組DNA文庫制備程序，制備插入大小約為400 bp 的成對末端文庫。通過Covaris將純化的基因組DNA剪切成所需大小的較小片段，并使用T4 DNA 聚合酶生成鈍端。在鈍性磷酸化DNA 片段的3'端添加“A”堿基后，將轉(zhuǎn)接器連接到DNA 片段的末端。所需片段可通過凝膠電泳純化，然后通過PCR選擇性富集和擴增，并進行了文庫質(zhì)量測試。合格的Illumina 對端文庫將用于Illumina NovaSeq 6000 測序（150 bp×2，上海BIOZERON 有限公司）。Trimmomatic 通過參數(shù)（version0.36http：//www. usadellab. org/cms/up?loads/supplementary/Trimmomatic）對原始配對末端讀數(shù)進行修剪，并對質(zhì)量進行控制從而獲得的干凈數(shù)據(jù)。使用 ABySS（http：//www.bcgsc.ca/plat?form/bioinfo/software/abyss）對多個Kmer參數(shù)進行基因組組裝，得到了最佳的組裝結(jié)果。隨后應用GapCloser 軟 件（https：//sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/）填補剩余的局部內(nèi)部空白，并糾正最終組裝結(jié)果的單堿基多態(tài)性。

1.7 固氮菌株對堆肥保氮能力的影響

將培養(yǎng)到109CFU的菌液按照10%（V/m）加入到羊糞中進行堆肥（60 cm×60 cm×45 cm泡沫箱），以無菌培養(yǎng)基為對照，共3個處理，分別記作CK、A3和B2。每個處理重復3 箱，含水率調(diào)至（60±1）%。堆肥時間為2021年8月28日～2021年9月15日。所有處理每隔2 d翻堆一次。于堆肥最后1 d取樣測定全氮量（TN）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)由Excel 2016 處理和繪圖。通過ab initio預測方法獲得2株細菌的基因模型，并用 Gen?eMark 鑒定。然后將所有基因模型與非冗余，即NCBI 中的NR 數(shù)據(jù)庫、SwissProt（http：//uniprot.org）、KEGG（http：//www. genome. jp/kegg/）和（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）進行blastp模塊的功能注釋，結(jié)合 Gene Ontology（http：//www.geneontology.org），通過eggnog-mapper （v5.0）比對，從而標準化這些生物功能注 釋術語。此外，使用tRNAscan SE （v1.23，http：//lowelab. ucsc. edu/tRNAscan-SE）鑒定tRNA，使用RNAmmer （v1.2，http：//www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/）測定rRNA。用Core基因分析結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。原始數(shù)據(jù)上傳到NCBI 數(shù)據(jù)庫，接收號為SUB11167856和SUB11167868。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學和生理生化特征

從高溫期和腐熟期的堆肥樣品中初步分離出11株固氮菌，根據(jù)對固氮能力的測定，最終篩選出2株高效固氮菌（分別用A3 和B2 表示），A3 為放線菌，B2為細菌。2株固氮菌的形態(tài)特征如圖1所示。A3的菌落呈菌絲生長，顏色呈灰色，菌落邊緣顏色較淺為白色，質(zhì)地干燥易挑起；B2的菌落均呈圓形，白色，表面呈蠟狀，菌落濕潤，邊緣完整。

圖1 2株固氮菌的菌落形態(tài)與細胞形態(tài)Figure 1 Colony morphology and cell morphology of two nitrogen-fixing strains.

生理生化測定結(jié)果顯示，A3 為革蘭氏陰性菌，B2 為革蘭氏陽性菌。A3 和B2 均可以使葡萄糖、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，其中B2產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。VP試驗中，A3和B2 均為陰性。MR 試驗中，B2 為陽性，A3 為陰性。2種菌均具有色氨酸酶，可以分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。兩種菌株均不能利用檸檬酸鹽，也不具有苯胺酸脫氫酶。B2具有類蛋白水解酶，可以使明膠液化。因此，初步判定A3屬于Nocardiopsis屬，B2屬于Ba?cillus屬。

2.2 菌株的固氮能力

固氮菌的固氮能力強弱直接決定了其應用前景。2株固氮菌培養(yǎng)7 d的固氮量如圖2所示。A3和B2的固氮量分別為7.88 mg/L和22.96 mg/L，B2菌株的固氮能力較強。

圖2 2株固氮菌固氮能力的比較Figure 2 Comparison of nitrogen fixation ability of two nitrogen-fixing strains.

2.3 菌株的最適生長條件和生長曲線

圖3 顯示了2 株固氮菌的最適生長條件和生長曲線。2 株固氮菌最適生長溫度均為45 ℃，屬于嗜熱菌［29-30］； B2 的最適pH 為7，A3 的最適pH 為10，2 株固氮菌在pH 5～10 內(nèi)均有生理活性，表明它們對pH 的適應范圍較廣；A3 和B2 均有一定的耐鹽性，B2的耐鹽性較高。以麥芽糖和酵母膏分別作為碳氮源時，2株固氮菌生長情況最好，但在其他碳氮源中也能生長良好，說明它們是廣幅營養(yǎng)性細菌。A3在20 h達到穩(wěn)定期，B2在22 h達到穩(wěn)定期，表明2種菌株都可以快速生長與繁殖。

圖3 2株固氮菌在不同生長條件下的生長情況和生長曲線Figure 3 The growth and its curve of two nitrogen-fixing strains under different growth conditions

表1 2種固氮菌株生理生化特性分析Table 1 Physiological characteristics and biochemical re?action of two nitrogen-fixing strains

2.4 菌株的功能性

2株菌株的功能性測定結(jié)果見表2。2株菌株均有產(chǎn)IAA的能力，A3和B2在3 d內(nèi)產(chǎn)生的IAA分別為3.76 mg/L和1.60 mg/L；A3和B2在PVK培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3 d后，B2培養(yǎng)基劃線呈藍色，說明B2能降解無機磷，定量分析B2 的無機磷溶解能力為1.76 mg/L；在有機磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，B2 出現(xiàn)磷解圈，說明其具有降解有機磷的能力。2株菌株在CAS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～7 d后，2株菌的培養(yǎng)基由藍變黃，說明其具有產(chǎn)鐵載體的能力。

表2 2株固氮菌的功能性Table 2 Function of two nitrogen-fixing strains

2.5 菌株的鑒定

16S rRNA 基因測序的菌株系統(tǒng)進化樹如圖4。菌株A3為達氏擬諾卡氏菌（Nocardiopsis dassonvil?lei），B2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖4 2個菌株的16s rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic trees derived from 16S rRNA gene sequences of two strains

2.6 菌株的功能注釋

GO 注釋結(jié)果如表3 所示，2 種微生物均有固氮基因（nif）和固氮酶，證明這2種微生物均為固氮菌。B2和A3具有NifU、NifB、NifS固氮基因及其編碼的固氮酶，并且B2具有一氧化氮雙加氧酶（NOD），在有氧過程中參與NO解毒，稱為一氧化氮雙加氧酶反應，可以利用O2和NAD（P）H將NO轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，不僅保護細菌免受各種有毒氮化合物的傷害，還可以將NO轉(zhuǎn)化為硝酸鹽固定下來，但NOD的酶活性受到同源還原酶的制約，因此A4能否將NO轉(zhuǎn)化為硝酸鹽還需進一步研究［31］。A1和B2具有轉(zhuǎn)導組氨酸激酶NtrY，參與菌株的固氮和調(diào)節(jié)氮代謝。

表3 2種菌株的固氮功能注釋Table 3 Nitrogen fixation gene annotation of two strains

除了固氮功能外，2株細菌還擁有其他具有利用價值的功能（表4～5）。2 種菌株均具有色氨酸酶（tryptophan，IAA的前體），參與了IAA的合成。2株菌都具有鐵載體代謝基因和鐵載體合成酶；B2具有參與代謝磷酸鹽的酶，這與上述功能性測定結(jié)果相符。A3 具有代謝重金屬的功能，可以代謝Cr6+，有Pb、Cd、Co、Ni的抗性基因；B2沒有代謝重金屬的功能，但有Mo、Ni、Co、Hg、Cr、As、Mn的抗性基因。因此A3 菌株有修復重金屬污染土壤的潛能。除此之外，B2還具有代謝鉀、鎂鹽的功能，并且在菌株的生長條件測定中，B2的耐鹽能力最強，可在8%鹽濃度的培養(yǎng)基中生長。

表4 2種菌株的其他功能注釋Table 4 Other gene annotation of two strains

2.7 菌株對堆肥保氮能力的影響

堆肥過程中有機氮的礦化和硝態(tài)氮的反硝化（NH3和N2O）造成氮的損失［32］，而固氮菌的添加可以減少堆肥過程中的氮素損失［10］。2 種菌株對堆肥的保氮能力見圖5。結(jié)果表明，堆肥過程中，A3處理的堆肥含氮量較CK 分別提高28.5%，而B2 菌株堆肥的含氮量較CK沒有顯著差異。表明A3菌株具有良好的堆肥保氮能力。

圖5 在堆肥中接種不同菌株后TN的變化Figure 5 Changes of TN after inoculating different strains in compost.

3 討論

本研究從高溫期和成熟期的堆肥樣品中分離出2 株嗜熱型固氮菌株，固氮量分別為7.88 mg/L 和22.96 mg/L，從玉米根際分離出的固氮菌Alcalig?enes faecalis的固氮能力為11.4 mg/L；從堿性土壤分離出的P.Borealis固氮能力為18.73 mg/L，但大多數(shù)固氮菌的固氮能力在6～10 mg/L［12-13］，因此本研究分離出的2株固氮菌均有良好的固氮能力。經(jīng)過測序，2 株固氮菌分別被鑒定為達氏擬諾卡氏菌（No?cardiopsis dassonvillei）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus ce?reus），其中蠟樣芽孢桿菌是已被證實的固氮菌［33-35］。

固氮菌是一種典型的中溫生物，一般在25～30 ℃的最適溫度下生長，土壤中的少數(shù)固氮菌可以在0 ℃生長。當溫度高于35 ℃時，固氮菌的生長速度會減緩，并通過萌發(fā)囊腫在高溫下存活［6］。固氮菌群的存在受pH 值控制，通常固氮菌的最適生長pH為7～7.5，而較低的pH 值（<6.0）會減少固氮菌群，甚至會完全抑制其生長。本研究所篩選的2株固氮菌最適溫度均為45 ℃，在20～55 ℃均能生長；2株固氮菌在pH5～10 內(nèi)均有活性，對pH 的適應范圍較廣。在堆肥過程中的pH 值一般在6.5～8.5［36］，這與分離出的固氮菌適應范圍一致，有利于固氮菌的新陳代謝。2株菌均有一定的耐鹽性，其中，B2（Bacil?lus cereus）最適鹽濃度可達8%。因此，2種固氮菌對環(huán)境條件的適應范圍較廣，不僅可以作為堆肥添加劑，還具有其他應用前景。

PGPB促進植物生長的機制可以分為直接作用和間接作用，前者是指微生物合成的IAA 和赤霉素等可以直接促進植物的生長，或改變土壤中某些元素的形態(tài)，從而促進植物吸收，比如固氮、溶磷等。間接作用是指菌株產(chǎn)生的某些物質(zhì)（如鐵載體和ACC等）能夠抑制或降低如缺鐵，植物病害和乙烯過量等不利因素對植物生長和產(chǎn)量的影響［36］。在本研究中，A3（Nocardiopsis dassonvillei）和B2（Bacillus cereus）均具有產(chǎn)鐵載體的能力。鐵載體是植物促生菌中確認的對抗性生物控制劑的機制之一［37-38］，具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株可以開發(fā)為植物病原體的有效生物控制劑。并且鐵載體可以與土壤中的重金屬離子螯合，形成可溶的重金屬-鐵載體螯合物，從而增加重金屬的活性［38］。其中，B2具有溶磷能力。磷酸鹽溶解能力是微生物的重要功能，解磷菌通過促進有機肥的轉(zhuǎn)化和不溶性磷酸鹽的利用來改善磷的活性，可以減少磷肥的施用［39］。除此之外，功能基因鑒定結(jié)果顯示A3（Nocardiopsis dassonvillei）和B2（Bacillus cereus）具有ACC 脫氨酶（1-aminocyclo?propane1-carboxylate）。ACC 脫氨酶是固氮菌的一個重要特性，ACC脫氨酶負責植物乙烯前體ACC分解為氨和酮丁酸，從而降低植物中的ACC 水平［40］。金屬抗性基因注釋（BacMet）結(jié)果顯示，A3 有Pb、Cd、Co、Ni 的抗性基因，并且可以代謝Cr6+；B2 有Mo、Ni、Co、Hg、Cr、As、Mn的抗性基因。因此A3菌株有修復重金屬污染土壤的潛能。金屬抗性基因可以使得A3和B2更好地適應環(huán)境中重金屬的脅迫。

在堆肥中接種微生物已被認為是一種清潔、有效地減少堆肥過程中氮損失的方法［41］。然而，由于堆肥環(huán)境中本身存在大量土著微生物，外源微生物進入堆肥后面臨微生物之間競爭的不確定性，導致微生物制劑對氮素的保留效果難以控制［42］。本研究結(jié)果表明，堆肥中添加A3菌株后，相較CK堆肥含氮量提高了28.5%，而添加B2菌株對堆肥含氮量沒有顯著影響；但2種菌株的固氮能力顯示，B2菌株的固氮能力顯著高于A3菌株。由此說明，外源固氮菌添加到堆肥中的演替和定殖是一個復雜的過程，即使是篩選于堆肥的固氮菌也不是都能夠提高堆肥的含氮量。當外源微生物添加到堆肥中可能由于土著優(yōu)勢微生物的激烈競爭而影響其生長和繁殖，詳細機理還有待于進一步深入研究。因此，對于堆肥中固氮菌的篩選不能單純看其固氮能力，更應看其實際應用的效果。

表5 2種菌株的金屬抗性基因及注釋Table 5 Metal restance gene and annotation of two strains

4 結(jié)論

菌株A3（Nocardiopsis dassonvillei）和B2（Ba?cillus cereus）都具有較強的固氮能力，并具有一定的促生，生防和防治土壤污染方面的功能。A3（Nocar?diopsis dassonvillei）可用作堆肥添加劑，提高堆肥中的氮素含量，生產(chǎn)固氮菌生物有機肥；而B2（Bacil?lus cereus）不具有提高堆肥中氮素含量的能力。但由于B2菌株良好的固氮能力和其他功能，具備研制微生物制劑的基礎，還需要進一步深入研究。