榮梓玉，凌鍵，李惠霞，張莉，張園園，王樂

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100089；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

由于內(nèi)蒙古地區(qū)海拔較高，夏季冷涼，已成為了我國最大的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)［1］，但隨著特色農(nóng)業(yè)的發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，連作現(xiàn)象也越來越普遍，連作后的土壤為病原菌提供了很好的寄生和繁殖的場所，使得病原菌數(shù)量遞增，從而造成了土壤中有益菌數(shù)量大量的減少。且多年的連作，造成馬鈴薯多種病害特別是土傳病害的發(fā)生日益嚴(yán)重，如馬鈴薯黃萎病、枯萎病、黑痣病、黑脛病、腐爛莖線蟲病、瘡痂病和粉痂病等在各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，從而導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)的含量有所降低，造成馬鈴薯的產(chǎn)量降低，影響了武川縣農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展，由于內(nèi)蒙古武川地區(qū)海拔較高，夏季冷涼，已成為了我國最大的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)［2］。馬鈴薯屬于淺根系植物對(duì)連作障礙十分敏感，多年連作后，馬鈴薯病害發(fā)生逐年加重［3］。草田輪作是提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量以及土壤質(zhì)量的栽培耕作方式之一［4］，世界上草田輪作主要分布于冷涼濕潤、畜牧業(yè)比重大的地區(qū)，例如西北歐、北歐、蘇聯(lián)西北部、美國東北部的五大湖地區(qū)。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，在英國曾長期實(shí)行的諾爾?？耸捷喿鳎ㄓ址Q四圃式輪作）逐步演變?yōu)榘?～4 a 牧草的草田輪作，如牧草→牧草→牧草→麥類→馬鈴薯→馬鈴薯→麥類→麥類→麥類。不同輪作系統(tǒng)間群落的組成、豐度的變化和微生物多樣性存在顯著差異［5］。而細(xì)菌是土壤微生物中分布最廣、數(shù)量最多的部分，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤養(yǎng)分變化的敏感指標(biāo)之一。因此，了解內(nèi)蒙古武川地區(qū)不同茬口牧草微生物多樣性及其差異，對(duì)當(dāng)?shù)伛R鈴薯等作物的安全生產(chǎn)具有重要意義。本試驗(yàn)擬觀測不同月份細(xì)菌群落的優(yōu)勢種類的分布和變化，了解4 種牧草種植前后土壤微生物結(jié)構(gòu)組成及其變化規(guī)律，為當(dāng)?shù)伛R鈴薯輪作制度的建立提供理論依據(jù)。

黑燕麥（Avena strigosa）作為主要的牧草之一，其生物學(xué)特性與燕麥相似，我國主要以河北、內(nèi)蒙古等地為主產(chǎn)地。現(xiàn)多地區(qū)開始采用種1 a 黑燕麥之后輪作其他農(nóng)作物［6］，研究發(fā)現(xiàn)，這樣不但可以有效的利用黑燕麥?zhǔn)斋@后充足的光熱資源，并且可以有效的提高土地利用率，是一種充分利用光熱資源、種養(yǎng)結(jié)合的新種植模式［7］。燕麥（Avena sativa）是一年生禾本科作物，是我國及世界上重要的農(nóng)作物之一，廣泛分布于東北、華北和西北等地區(qū)，由于燕麥的耐寒耐旱的生物學(xué)特性，在我國高海拔地區(qū)廣泛種植，也解決了高寒地區(qū)農(nóng)牧飼料短缺的問題［8］。箭筈豌豆（Vicia sativa）也叫“野豌豆”，一年生或越年生草本植物，是常見的飼草作物之一，耐寒、抗旱、適應(yīng)性強(qiáng)，但不耐鹽堿、不耐漬，同時(shí)也可以固氮并且豐富土壤營養(yǎng)、提高土壤肥力等優(yōu)點(diǎn)受到廣大農(nóng)牧民的歡迎［9］。毛苕子（Vicia villosa）是一年生或越年生的豆科草本植物，耐寒性極強(qiáng)，可在-30 ℃的環(huán)境中生存［10］，所以很適合高寒地區(qū)的種植，也是高寒地區(qū)常見的飼草之一，一般用于秋播或在作物行間間作，可以有效的提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，且可以保護(hù)生態(tài)環(huán)境［11］。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)基本情況

武川縣位于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市北部，屬于中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，冬季嚴(yán)寒多雪，夏季雨量充沛，歷年平均降水約為354.1 mm。晝夜溫差及冬夏溫差較大，年平均氣溫3.0 ℃，氣候特點(diǎn)是日照充足。海拔1 800～2 200 m，三面環(huán)山構(gòu)成了武川盆地，由于這樣的氣候環(huán)境所以武川縣適合黑燕麥、燕麥、箭筈豌豆和毛苕子這4種牧草的生長，以及當(dāng)?shù)刂饕霓r(nóng)作物為馬鈴薯。

1.2 土壤采樣及土壤樣品處理

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣境內(nèi)，N 41°10′37″，E 111°22′31″。由于草田輪作通常選取豆科牧草或者禾本科牧草進(jìn)行單播或混播，所以選取這4種牧草為試驗(yàn)對(duì)象。采樣地前2 a都種植的是馬鈴薯，由于連作2 a馬鈴薯，所以今年種植以上4種牧草。采樣地是由24 塊3 m×3 m 的小區(qū)組成的一塊土地，小區(qū)間距為1 m，坡度相同以及土壤類型也相同，每種牧草都在同一塊土地并有6個(gè)重復(fù)，采用三點(diǎn)取樣法采集土樣，用取樣器采取作物根周0～30 cm 土壤，三點(diǎn)小樣組成一個(gè)混合樣，每種牧草共采取6個(gè)混合樣。分別于2021年5～9月進(jìn)行采樣并對(duì)每個(gè)月進(jìn)行時(shí)期編號(hào)（表1），每個(gè)月的采樣步驟相同，樣品混成一點(diǎn)后先進(jìn)行編號(hào)（表2），例如：黑燕麥A1～A6，然后用鑷子挑出石粒、雜草、根系以及凋落物碎屑，放入無菌塑封袋，記錄采集信息，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 采樣時(shí)間基本情況Table 1 Basic information of sampling time

表2 牧草土土壤樣品名稱及編號(hào)Table 2 Names and numbers of soil samples

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

選用土壤DNA試劑盒（MagPure Soil DNA LQ Kit）提取牧草根周土壤細(xì)菌DNA，采用Nanodrop對(duì)DNA 進(jìn)行定量后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。牧草根周土壤細(xì)菌使用前引物序列（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和后引物序列（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)16S rRNA在V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增測序，擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。由上海派森諾生物科技有限公司采用Illumina平臺(tái)測序。

測序后，按照下列程序分析土壤細(xì)菌生物學(xué)信息。第一步將雙端16S rRNA 擴(kuò)增子序列reads 拼接，把質(zhì)濾后的數(shù)據(jù)除去正向和反向引物序列，使用Vsearch［12］的fastq_mergepairs 模塊拼接序列以及使用fastq_filter 模塊對(duì)拼接序列進(jìn)行質(zhì)控，接著將reads去冗余并保留拷貝數(shù)大于2的reads，然后在相似度為97%的條件下進(jìn)行聚類［13］，16S rRNA 在除去嵌合體后基于greengenes 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類，除去不符合的OTU（operational taxonomic units，即操作分類單元），最后在相似度為97%的條件下構(gòu)建OTU 表格，并在各水平（門、綱、目、科、屬、種）統(tǒng)計(jì)每一個(gè)樣品的群落組成。使用Qiime 軟件（ver?sion1.9.1）生成不同分類水平上的豐度表，并進(jìn)行Al?pha多樣性指數(shù)（Chao1、Shannan、Simpson、ACE）的計(jì)算。基于 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析組間差異指數(shù)，以P<0.05 作為差異顯著性篩選閾值［14］。使用R（version4.0.5）的edgeR［15］包、ggplot2［16］包及vegan［17］等包對(duì)微生物的差異富集、繪制圖表或散點(diǎn)圖及非度量多維尺度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同牧草根周土壤的測序結(jié)果分析

測序結(jié)果顯示，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)黑燕麥、燕麥、箭筈豌豆和毛苕子的有效序列數(shù)見表3如下顯示，土樣中總共得到細(xì)菌總有效序列依次為黑燕麥1 672 976條、燕麥1 526 841 條、箭筈豌豆1 299 510 條和毛苕子1 514 492 條，其中，黑燕麥的有效序列數(shù)最多，比箭筈豌豆增多了22.32%，比毛苕子增多了9.47%，比燕麥多了8.73%。

表3 不同牧草5個(gè)時(shí)期土壤的有效序列數(shù)Table 3 The effective sequence number of soil in 5 periods of different forages

2.2 不同牧草根周土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同牧草根周土壤OTU數(shù) 如圖1，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中黑燕麥（A）的細(xì)菌OTU總數(shù)為13 176條、燕麥（B）的細(xì)菌OTU 總數(shù)為12 114 條、箭筈豌豆（C）的細(xì)菌OTU總數(shù)為11 587條以及毛苕子（D）的細(xì)菌OTU 總數(shù)為12 153 條。其中4 個(gè)樣品中共同擁有的OTU總數(shù)為5 827條。其中黑燕麥特有的細(xì)菌OTU總數(shù)最多，比箭筈豌豆多12.05%，比燕麥多8.06%，比毛苕子多7.76%，也說明了黑燕麥中含有特有微生物種類較多。

圖1 細(xì)菌OTUs分布Venn圖Figure 1 Venn graph of bacteria OTUs distribution

2.2.2 不同牧草根周土壤細(xì)菌的門水平群落結(jié)構(gòu) 由圖2 可知，在門的水平，4 種牧草土壤微生物占優(yōu)勢的細(xì)菌差異不顯著，其中放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）及芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等為優(yōu)勢菌門。細(xì)菌的各門之間相對(duì)豐度差異較小，如放線菌門在燕麥（B）中的相對(duì)豐度最高，為57.25%，箭筈豌豆（C）的相對(duì)豐度最低，為53.62%，從高到低依次排序?yàn)椋貉帑湥˙）>黑燕麥（A）>毛苕子（D）>箭筈豌豆（C）。在變形菌門中，細(xì)菌相對(duì)豐度從高到低依次排序?yàn)?，箭筈豌豆（C）>黑燕麥（A）>毛苕子（D）>燕麥（B），但其他門細(xì)菌在4種牧草間相對(duì)豐度差異不顯著。軟壁菌門（Tenericutes）是黑燕麥中特有，GN04是燕麥中特有的細(xì)菌門，箭筈豌豆和毛苕子中無特有的細(xì)菌門。

圖2 4種牧草土壤的細(xì)菌群落在門水平上的相對(duì)豐度Figure 2 Relative abundance of bacterial communities at phylum level in four pasture soils

2.2.3 不同牧草根周土壤細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)黑燕麥（A）、燕麥（B）、箭筈豌豆（C）和毛苕子（D）土壤微生物分別包含了485、472、459和463個(gè)細(xì)菌屬，由圖3可知，鞘氨醇單胞菌屬（Kaistobacter）、科氏游動(dòng) 菌 屬（Couchioplanes）、假 諾 卡 氏 菌 屬（Pseudonocardia）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、氣微菌屬（Aeromicrobium）及分枝桿菌屬（Mycobacterium）的相對(duì)豐度較高，其中鞘氨醇單胞菌屬為相對(duì)豐度最高的菌屬，分別占2.35%、2.73%、2.25%和2.39%，總體而言，4種牧草的土壤微生物在屬的水平上差異不明顯，相似度較高。

圖3 4種牧草土壤的細(xì)菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundance of bacterial communities at genus level in four pasture soils

2.3 不同牧草根周土壤細(xì)菌多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性分析 Alpha多樣性是用于測量微生物群落之間的種類數(shù)量，可以反映微生物群落之間通過競爭資源或者利用同種生境而產(chǎn)生的共存結(jié)果。稀釋曲線一般用于樣品測序量是否達(dá)到飽和的評(píng)估，如果樣品測序深度增大但曲線斜率平滑，證明測序量已達(dá)到飽和，如果再增加，Alpha 多樣性指數(shù)也不會(huì)有顯著變化以及各個(gè)指數(shù)都達(dá)到穩(wěn)定的程度。如圖4為每種牧草在不同時(shí)期的稀疏曲線，可以發(fā)現(xiàn)樣品在3 000 OTU左右達(dá)到飽和。圖5為每種牧草在同一時(shí)期的稀疏曲線。由于t1時(shí)期是種植牧草前的時(shí)期，所以只能用種植牧草后的4個(gè)時(shí)期來表示?？梢园l(fā)現(xiàn)，樣品在2 000～3 000 OTU 時(shí)達(dá)到飽和，這也說明作物的Alpha多樣性趨于穩(wěn)定。

圖4 四種牧草在不同時(shí)期的Alpha多樣性稀釋曲線圖Figure 4 Rarefaction curves of Alpha diversity of four forages species at different times

圖5 四種牧草在相同時(shí)期的Alpha多樣性稀釋曲線圖Figure 5 Rarefaction curves of Alpha diversity of four forages species at the same times

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是用來估計(jì)微生物群落含OTU 數(shù)目的指數(shù)，Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)是反映微生物多樣性的指數(shù)之一，Simpson 指數(shù)越大，說明群落多樣性就越低，而Shannon 指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。Coverage是指樣品文庫的覆蓋率，其指數(shù)越高，樣品中沒有被測出的概率就越低。由表4可知，相比于黑燕麥，燕麥、箭筈豌豆和毛苕子的微生物多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）均比黑燕麥少，其中黑燕麥的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)也均高于其他3 種牧草，可以說明黑燕麥的土壤微生物豐富度最高，Coverage 值都在0.98 以上，說明結(jié)果比較真實(shí)以及可以更好的反應(yīng)出4種牧草土壤微生物多樣性。

表4 不同牧草根周土壤微生物alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity index of soil microorganisms around root of different crops

2.3.2 Beta 多樣性分析 Beta 多樣性是衡量微生物群落之間的差別，可以更好的描述生境內(nèi)的微生物種類的數(shù)量，可以將同一樣品與不同樣品不同條件下的比較，也可以反映不同樣品的群落組成的相似性及差異性。如圖6，4 種牧草在5 個(gè)時(shí)期的差異是比較顯著的（P<0.05），可以看出，箭筈豌豆的差異不像其他3種牧草那么明顯，但一般來說，每種牧草都是隨時(shí)間變化的，反映了Beta 的多樣性是不同的，而這種差異是由于時(shí)間的變化造成的。如圖7，同一時(shí)期4種牧草的差異是非常顯著的（P<0.05）。由于t1時(shí)期是種植牧草前的時(shí)期，所以只能用種植后的4 個(gè)時(shí)期來表示。從t2到t5的趨勢是t2時(shí)期各組聚集在一起，t3～t4期逐漸開始分離，最后t5時(shí)期各組顯著分散。不同牧草的土壤樣品分布在相同地區(qū)，說明4 種作物土壤微生物在不同時(shí)期的變化存在顯著差異，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在顯著差異。因此，不同牧草的栽培顯著影響了土壤細(xì)菌群落的組成。

圖6 四種牧草在不同時(shí)期Beta多樣性的CCA分析圖Figure 6 CCA diagram of Beta diversity of four forages in different periods

圖7 四種牧草在相同時(shí)期Beta多樣性的CCA分析圖Figure 7 CCA diagram of Beta diversity of four forages in the same period

3 討論

土壤微生物是微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是草田輪作模式的重要影響因子之一，每種牧草在不同時(shí)期的生長階段中，土壤微生物的組成以數(shù)量也發(fā)生一定的變化。由于5月是未種植牧草的時(shí)期，所以微生物多樣性以及豐富度相對(duì)較低，6～8 月是牧草的生長期，隨著牧草迅速的生長，土壤中的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化比較快，土壤中的微生物的數(shù)量也迅速增多，其中8月是微生物數(shù)量最多的時(shí)期，9月是牧草收獲后的時(shí)期，所以土壤微生物數(shù)量明顯降低，土壤微生物數(shù)量從5 月到9 月呈現(xiàn)的是先增加后降低的變化規(guī)律。與連作相比，輪作改變了微生物的環(huán)境因子，更有利于作物根系生長以及對(duì)土壤的養(yǎng)分吸收，從而促進(jìn)微生物的生長和繁殖，因此草田輪作的方式的土壤微生物數(shù)量高于作物的連作方式。4種牧草土壤細(xì)菌群落在門水平上的優(yōu)勢菌進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門以及芽單胞菌門為門水平上優(yōu)勢菌門，而這些優(yōu)勢菌在很多植物的土壤中都有富集［18］，也可以說明該地土壤具有一般土壤微生物優(yōu)勢菌群組成的共性，只是它們的占比大有不同。據(jù)研究，放線菌類在土壤中可以促使動(dòng)植物的殘骸腐爛［19］，提高植物抗病性以及抑制病原菌的生長［20］，在氮素循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用。變形菌門的微生物多為兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活微生物［21］；酸桿菌門在土壤中可降解植物殘?bào)w、參與單碳化合物代謝［22］。以及大部分土壤優(yōu)勢菌都或多或少對(duì)土壤起著重要的作用。4種牧草土壤細(xì)菌群落在屬水平上的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬、科氏游動(dòng)菌屬、鹽單胞菌屬以及芽孢桿菌屬等為優(yōu)勢菌屬，據(jù)研究，鞘氨醇單胞菌屬是一種新型的生物資源，其中最顯著的一個(gè)特征為降解單環(huán)或者多環(huán)芳香族化合物［23］，可以利用鞘氨醇單胞菌屬的這些芳香族化合物提供碳源進(jìn)行生長，以及其他菌屬之間互相影響互相制約，形成穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境。

通過Alpha和Beta多樣性的分析，4種牧草土壤微生物的細(xì)菌群落豐富度和多樣性分析存在著較明顯的差異，4 個(gè)時(shí)期的CCA 在隨時(shí)期的變化而變得差異越來越顯著，根據(jù)試驗(yàn)得出，土壤微生物多樣性以及豐富度在季節(jié)上的變化很明顯，大部分表現(xiàn)為夏季或者天氣炎熱的時(shí)候要明顯顯著于其他季節(jié)或時(shí)期。合理輪作是防止土壤連作障礙發(fā)生的有效途徑，根據(jù)Alpha多樣性結(jié)果分析，黑燕麥的土壤微生物多樣性、豐富度和微生物數(shù)量要比其他3種牧草有顯著差異，所以黑燕麥與馬鈴薯的輪作方式相比于其他3種輪作方式來說是最好選擇。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，4種牧草的土壤微生物群落組成相對(duì)穩(wěn)定，細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)在不同時(shí)期或者不同季節(jié)中存在著很顯著的差異。結(jié)果顯示，黑燕麥的土壤微生物多樣性及豐富度顯著高于其他3種牧草，并且土壤生物活性顯著提高，土壤微生物增多，從而維持或提高草田輪作的土壤質(zhì)量，達(dá)到農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營的目的。因此，黑燕麥與燕麥、箭筈豌豆以及毛苕子相比，黑燕麥輪作馬鈴薯的模式細(xì)菌群落多樣性顯著高于其他模式，將有利于保持土壤微生物多樣性及豐富度，也提高了土地的利用率和利用效率。