張文淵，張國斌，張帥磊，李嘉琪，呂劍，羅石磊

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

鹽脅迫是影響作物養(yǎng)分吸收、生長和產(chǎn)量的常見環(huán)境脅迫之一。過高的鹽濃度會對植物細(xì)胞產(chǎn)生許多負(fù)面影響，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)Na+、K+失衡，產(chǎn)生離子毒性、滲透脅迫，導(dǎo)致植物水分缺失、營養(yǎng)不良和氧化應(yīng)激損傷［1］。研究表明，鹽脅迫下植物生長量的減少發(fā)生在兩個階段：對外部滲透壓增加的快速響應(yīng)和葉片中Na+積累的較慢響應(yīng)，表現(xiàn)為鹽脅迫導(dǎo)致作物滲透失調(diào)從而抑制作物的幼葉生長，通過Na+的積累加速成熟葉片衰老［2］。同時，鹽脅迫通過分解葉綠素、抑制Rubisco活性和降解光合器官中的膜蛋白，從而影響植物的光合效率。另外，鹽脅迫會誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生與積累活性氧，造成植物細(xì)胞膜系統(tǒng)與細(xì)胞器的氧化損傷［3］。

我國設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展較快，化學(xué)肥料的大量施入以及不合理的灌溉措施導(dǎo)致土壤次生鹽漬化嚴(yán)重，黃瓜（Cucumis sativusL.）作為我國設(shè)施栽培面積較大的蔬菜作物之一，其根系淺，根量少，在幼苗期對鹽脅迫尤為敏感［4］。土壤含鹽量過高會對黃瓜的生長過程產(chǎn)生嚴(yán)重影響，降低其產(chǎn)量和品質(zhì)，極大地影響經(jīng)濟(jì)效益，因此增強(qiáng)黃瓜耐鹽性尤為重要。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）之后被發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子［5］，在植物體中可自由跨膜，極易透過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，擴(kuò)散到達(dá)細(xì)胞內(nèi)隔間發(fā)揮作用［6］。已有研究表明，H2S 參與植物對鹽脅迫的響應(yīng)，陳明媛等［7］研究發(fā)現(xiàn)，H2S 可以增強(qiáng)鹽脅迫下棉花幼苗光合效率，提高抗氧化酶活性，緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的生長抑制。劉建新等［8］研究發(fā)現(xiàn)，H2S 可提高裸燕麥幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，緩解鹽堿脅迫造成的滲透失衡。Shan 等［9］研究發(fā)現(xiàn)H2S 預(yù)處理可以通過提高玉米幼苗的抗氧化能力來緩解高鹽傷害。除此之外，前人對于H2S 緩解黃瓜鹽脅迫的研究已有報道，但多以根施［10］及預(yù)處理［11］的處理方法，研究H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗的影響，而以葉面持續(xù)噴施NaHS 的方式則鮮見報道。因此，本研究以新春四號黃瓜為試材，采用葉面噴施H2S 供體NaHS 和 H2S 合成抑制劑PAG 的方法，探討外源施加H2S 以及抑制內(nèi)源H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗滲調(diào)物質(zhì)、葉綠素、最大光化學(xué)效率與抗氧化系統(tǒng)的影響，旨在探明H2S 提高黃瓜幼苗耐鹽性的生理機(jī)制，為緩解黃瓜鹽脅迫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與植物生長條件

H2S 供體NaHS 購自MACKLIN 公司（中國上海），H2S內(nèi)源合成抑制劑PAG（DL-炔丙基甘氨酸）購自源葉生物試劑公司（中國上海）。供試材料采用黃瓜品種新春四號（Cucumis sativusL.cv.Xinchun No.4），購自山東省新泰市科潤種業(yè)有限公司，黃瓜幼苗栽培與處理于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院人工氣候箱中進(jìn)行。

黃瓜種子于0.03%高錳酸鉀溶液中消毒5 min，蒸餾水洗滌并浸泡5 h，播于鋪2 層濕潤濾紙的育苗盤中，25 ℃黑暗條件下保鮮膜覆蓋以保持水分，待種子露白后調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為28 ℃/18 ℃、晝夜各12 h，光照度為20 000 lx。將7 d 齡黃瓜幼苗移至容量為1 L的黑色水培盒。營養(yǎng)液采用改良霍格蘭營養(yǎng)液，幼苗在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為28 ℃/18 ℃，光照度為30 000 lx，晝夜各12 h。

1.2 NaHS處理濃度篩選及處理時間優(yōu)化

NaHS 濃度篩選：黃瓜幼苗苗齡20 d，長至兩葉一心時，對黃瓜幼苗營養(yǎng)液中施加50 mmol/L 濃度的鹽脅迫，鹽濃度的選擇參考武玥的研究［12］，設(shè)置100、200、400、600、800 μmol/L等濃度NaHS溶液噴施葉面，以確定最適NaHS噴施濃度，葉片噴施以溶液霧化水珠均勻分布于葉片表面為度。連續(xù)處理7 d后取整株幼苗，烘干稱取干質(zhì)量。每個處理4盆，每盆3株，共12株，重復(fù)3次。

NaHS處理時間間隔篩選：以篩選出的NaHS濃度進(jìn)行時間間隔的篩選，設(shè)置以下處理：T0（鹽脅迫下噴施蒸餾水）；T1（鹽脅迫下200 μmol/L NaHS 溶液每天處理1 次）；T2（鹽脅迫下200 μmol/L NaHS溶液隔天處理）；T3（鹽脅迫下200 μmol/L NaHS 溶液隔2 d處理1次），處理7 d后，根據(jù)干質(zhì)量確定最佳處理時間間隔，處理樣本數(shù)與重復(fù)同上。

1.3 試驗處理

挑選20 d 苗齡長勢一致的黃瓜幼苗，進(jìn)行試驗處理，試驗設(shè)計如表1所示，每個處理5盆，每盆3株，共15株，重復(fù)3次。處理7 d后，取黃瓜幼苗第2片真葉，剪碎混勻，將樣品存于-80 ℃超低溫冰箱中待測。

表1 試驗處理Table 1 Experimental processing

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 黃瓜幼苗全株干質(zhì)量的測定 幼苗全株干質(zhì)量參考呂劍等［13］的方法測定。將處理7 d 的全株黃瓜幼苗于烘箱中105 ℃殺青，之后80 ℃烘至恒質(zhì)量后用千分之一電子天平稱其干質(zhì)量。

1.4.2 光合色素含量及Fv/Fm的測定 葉綠素與類胡蘿卜素含量采用95%乙醇法測定。Fv/Fm采用Handy PEA 儀 器 （ Plant Efficiency Analyser；Hansatech Instrument Ltd.，UK），將7 d 處理結(jié)束的幼苗第2 片真葉暗適應(yīng)15 min 后進(jìn)行測定，每個處理至少測量9次。

1.4.3 可溶性糖、脯氨酸、過氧化氫和丙二醛含量的測定 可溶性糖含量采用蒽酮法測定，脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸 （TBA）法測定，具體操作步驟參考陳剛等［14］的方法。過氧化氫含量測定采用過氧化氫含量檢測試劑盒，購自索萊寶（Solarbio）試劑公司。上述指標(biāo)的測定均設(shè)置3個重復(fù)。

1.4.4 抗氧化酶活性的測定 過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等酶活性的測定，均參考陳剛等［14］的方法，使用UV-1800 紫外分光光度計測定，每個處理重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，IBM SPSS Statistics 25 對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），顯著性檢驗水平為P<0.05，用Origin 2018作圖，數(shù)據(jù)用3個獨立試驗的±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHS噴施濃度與處理時間間隔篩選

如圖1-A所示，與鹽脅迫相比，隨著NaHS濃度的增加，黃瓜幼苗干重分別增加16.64%、32.55%、15.94%和2.85%，濃度為800 μmol/L 時，幼苗全株干質(zhì)量降低2.92%，幼苗生長受到抑制，200 μmol/L NaHS 處理顯著高于其他濃度處理，表明200 μmol/L NaHS 緩解NaCl 脅迫誘導(dǎo)的生長抑制的效果最好。如圖1-B所示，與T0相比，T1、T2與T3對鹽脅迫下黃瓜幼苗生長抑制均有緩解作用，干質(zhì)量分別顯著增加11.47%、23.33%和11.61%，T2處理顯著高于T1、T3，緩解效果最好，表明NaHS 持續(xù)處理會使細(xì)胞內(nèi)H2S 過多積累而不利于植株生長。故后期試驗處理采用200 μmol/L NaHS隔天噴施的處理方式。

圖1 度不同NaHS濃度及不同處理間隔對鹽脅迫下黃瓜幼苗干重的影響Figure 1 Effects of different NaHS concentrations and treatment intervals on dry weight of cucumber seedlings under salt stress

2.2 H2S對鹽脅迫下黃瓜幼苗生長的影響

在50 mmol/L NaCl 脅 迫 下，NaHS 與PAG 處理7 d，觀察黃瓜幼苗形態(tài)，測定其地上部與地下部干質(zhì)量（圖2）。與CK 相比，NaCl 處理下黃瓜幼苗的生長出現(xiàn)明顯的抑制效果（圖2-A），地上干質(zhì)量和地下干質(zhì)量分別降低了24.78%和46.90%。與NaCl 處理相比，NaHS 處理緩解了NaCl 對黃瓜幼苗生長的抑制，地上干質(zhì)量和地下干質(zhì)量均顯著增加29.12%和48.52%；PAG 處理加重了鹽脅迫下的生長抑制，分別降低10.36% 和12.09%（圖2-B～C）。

圖2 H2S對鹽脅迫下黃瓜幼苗生長的影響Figure 2 Effects of H2S on cucumber seedling growth under salt stress

2.3 H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片光合色素含量的影響

與CK相比，NaCl脅迫使黃瓜幼苗葉片葉綠素 a（圖3-A）、葉綠素 b（圖3-B）和總?cè)~綠素（圖3-C）含量均顯著降低，分別降低11.86%、6.38%和5.47%；NaCl+NaHS 處理減少了NaCl 誘導(dǎo)的黃瓜幼苗葉片各葉綠素組分含量的降低，與NaCl 處理相比，分別增加1.95%、2.69%和2.15%；NaCl+PAG 處理則加重了NaCl脅迫下葉綠素a和葉綠素b含量的降低。如圖3-D所示，與CK相比，NaCl處理導(dǎo)致黃瓜葉片類胡蘿卜素含量顯著降低17.54%，NaCl+NaHS 處理下，葉片類胡蘿卜素含量顯著增加47.8%；而PAG 處理的黃瓜葉片類胡蘿卜素含量降低到CK處理的1/5左右。

圖3 H2S對鹽脅迫下黃瓜幼苗光合色素含量的影響Figure 3 Effect of H2S on photosynthetic pigment content of cucumber seedlings under salt stress

2.4 H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的影響

由圖4 可知，鹽脅迫處理的黃瓜幼苗Fv/Fm（PSII 最大光化學(xué)效率）比值顯著降低，而H2S 供體NaHS噴施處理使黃瓜幼苗在鹽脅迫下PSII維持較高的量子效率。此外，NaCl+PAG處理下，F(xiàn)v/Fm比值較NaCl處理有所降低，但不顯著。

圖4 H2S對鹽脅迫下黃瓜葉片F(xiàn)v/Fm的影響Figure 4 Effects of H2S on Fv/Fm of cucumber leaves under salt stress

2.5 H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗滲調(diào)物質(zhì)含量的影響

由圖5可知，與CK 相比，NaCl處理下黃瓜葉片中可溶性糖和脯氨酸的含量顯著提高，分別提高2.94 倍和50.74%。與NaCl 處理相比，NaCl+PAG處理降低可溶性糖含量和脯氨酸的含量的積累，分別降低29.89%和19.92%，NaCl+NaHS 處理則較NaCl 處理顯著提高，分別升高53.99%和22.21%。說明H2S 促進(jìn)黃瓜幼苗可溶性糖與脯氨酸的積累，提高耐鹽性。

圖5 H2S對鹽脅迫下黃瓜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Figure 5 Effects of H2S on osmotic substances in cucumber seedlings under salt stress

2.6 H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗丙二醛與過氧化氫含量的影響

如圖6所示，與CK 相比，NaCl處理下黃瓜幼苗葉片H2O2增加 2.98 倍，MDA 含量增加29.89%，NaCl+NaHS 處理的黃瓜幼苗葉片H2O2含量和MDA 含量較NaCl 處理顯著降低了37.79% 和24.27%；而NaCl+PAG處理下，黃瓜幼苗葉片H2O2含量和MDA含量較NaCl升高14.59%和9.65%。

圖6 H2S對鹽脅迫下黃瓜幼苗丙二醛與過氧化氫含量的影響Figure 6 Effect of H2S on malondialdehyde and hydrogen peroxide contents in cucumber seedlings under salt stress

2.7 H2S 對鹽脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

為進(jìn)一步闡明NaHS在緩解鹽脅迫下黃瓜幼苗氧化應(yīng)激中的作用，測定了不同處理下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶的活性，如圖7，與CK相比，NaCl處理顯著增加了葉片中POD、CAT、SOD 和APX 的活性，分別增加了66.16%、7.14%、212.50%和73.03%。NaHS 的施用逆轉(zhuǎn)了NaCl處理引起的酶活變化，較NaCl 處理分別降低了43.95%、2.13%、20.80%和32.68%，使其接近CK水平。而NaCl+PAG處理下活性POD、CAT 和APX 較NaCl 處理顯著升高，SOD略有降低，但不顯著。

圖7 H2S對鹽脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響Figure 7 Effects of H2S on antioxidant enzyme activities of cucumber seedlings under salt stress

3 討論

大量研究表明，H2S 參與植物對多種脅迫的適應(yīng)反應(yīng)，在促進(jìn)植物對環(huán)境脅迫的耐受性和減輕其對植物的有害影響方面發(fā)揮著重要作用［15-16］，包括緩解重金屬離子對植物的毒害［17-18］、提高植物抗旱能力［19］、增強(qiáng)植物的耐熱性［20］等。此外，H2S對提高植物的耐鹽性方面有重要的作用，研究表明H2S 通過維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和氧化代謝調(diào)節(jié)水稻的耐鹽性［21］，維持?jǐn)M南芥較低的Na+/K+比值以抵御鹽脅迫［22］。

當(dāng)植物遭受脅迫時，植物細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生過量活性氧對植物細(xì)胞造成氧化損傷，損壞葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素合成，而葉綠素含量與Fv/Fm密切相關(guān)［23］。植物葉片暗適應(yīng)下Fv/Fm被認(rèn)為是反映脅迫下植株光抑制的良好指標(biāo)［24］。H2S作為一種重要的內(nèi)源氣體信號分子，在促進(jìn)葉綠體的生物合成方面表現(xiàn)出重要作用［25］。研究表明，H2S 緩解了NaCl脅迫下黃瓜幼苗光合特性和葉綠素?zé)晒獾慕档?，改善NaCl誘導(dǎo)的生長抑制［10］。本試驗發(fā)現(xiàn)H2S顯著緩解鹽脅迫下葉綠素含量的降低，促進(jìn)了葉綠素的生物合成，同時，H2S可以使黃瓜葉片在鹽脅迫下可以維持較高的PSII最大光化學(xué)效率Fv/Fm。這與Chen等［25］的研究結(jié)果一致。類胡蘿卜素在光合作用中與葉綠素共同參與光合成與光保護(hù)，可清除過剩光能防止光氧化損傷［26］。在非光合器官中，類胡蘿卜素充當(dāng)光抗氧化劑，光保護(hù)劑以及脫落酸、胡蘿卜內(nèi)酯等植物激素的合成前體，可提高植物抗逆性，調(diào)節(jié)植物生長［27-28］。本試驗發(fā)現(xiàn)，NaCl 脅迫顯著抑制了葉片類胡蘿卜素的積累，PAG處理加重了抑制效果，NaHS處理則有助于葉片類胡蘿卜素的積累，但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

植物在逆境下，通過滲透調(diào)節(jié)增加胞內(nèi)溶質(zhì)濃度降低滲透勢，從而保持細(xì)胞吸水能力，維持正常代謝活動［29］。研究表明H2S 可誘導(dǎo)內(nèi)源脯氨酸積累，提高玉米的耐熱性［30］。此外，H2S 提高香蕉果實脯氨酸含量，從而抵御冷害［31］。本試驗結(jié)果表明，黃瓜幼苗在鹽脅迫下自身積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以維持滲透壓，緩解滲透脅迫。H2S增強(qiáng)黃瓜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，相反，內(nèi)源抑制H2S合成則阻礙了黃瓜幼苗滲調(diào)物質(zhì)的積累。此結(jié)果表明，H2S參與黃瓜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的產(chǎn)生與積累，說明外源H2S 可在黃瓜幼苗自身響應(yīng)鹽脅迫的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強(qiáng)黃瓜葉片中可溶性糖和脯氨酸的產(chǎn)生，以增強(qiáng)黃瓜幼苗的耐鹽性［32］。這與劉建新等［33］和王紅艷等［34］的研究結(jié)果一致。

MDA和H2O2均被認(rèn)為是反映植物細(xì)胞氧化應(yīng)激的指標(biāo)。研究表明；外源H2S可降低活性氧積累，減少氧化應(yīng)激，增強(qiáng)棉花幼苗耐鹽性［34］。H2S 通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，降低活性氧與MDA 的積累，從而減輕了NaCl 誘導(dǎo)的黃瓜幼苗氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］。本試驗結(jié)果表明，NaHS 的外源加入，降低了黃瓜幼苗葉片MDA 和H2O2的積累，緩解了鹽脅迫下氧化應(yīng)激。這與前人的研究結(jié)果一致。PAG的加入，使得H2O2和MDA 含量增加，表明了內(nèi)源H2S 在鹽脅迫下減少黃瓜幼苗過量活性氧產(chǎn)生與防止脂質(zhì)過氧化方面發(fā)揮了作用。

抗氧化酶作為植物體抗氧化物質(zhì)的重要組分，對于外源添加NaHS 后的處于各類脅迫中的植物，其細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性大多都會有明顯的提升。外源NaHS 提高了硝酸鹽脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶SOD、 CAT、POD 和APX 的活性［35］，增強(qiáng)了抗氧化酶的活性以緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的黃瓜下胚軸和胚根的氧化損傷［36］。同樣，NaHS處理提高鎘脅迫下紫花苜?？寡趸傅幕钚裕?7］，說明H2S 可激活植物抗氧化酶活性以應(yīng)對外界脅迫。但由于植物體內(nèi)還存在各種抗氧化系統(tǒng)及抗氧化劑，若其可以充分消除細(xì)胞內(nèi)積累的過量活性氧時，植物為高效利用能量則不再啟用酶活［38］，例如，H2S 減少鎘誘導(dǎo)的青稞葉片MDA 和H2O2含量的增加，且減少鎘脅迫下的抗氧化酶活性的升高［38］。本試驗發(fā)現(xiàn)外源H2S使鹽脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性降低，同時H2O2與MDA含量降低，這與Jiang 等［10］和趙艷等［38］的結(jié)果類似。導(dǎo)致這一結(jié)果主要原因可能取決于脅迫的嚴(yán)重程度，極端的脅迫會抑制抗氧化酶的活性，植物會增強(qiáng)各種抗氧化系統(tǒng)與促進(jìn)抗氧化劑的產(chǎn)生來全力保護(hù)植物［39］，而處于中度或輕度的脅迫下，植物可以自行激活抗氧化酶系統(tǒng)，酶活性得到增強(qiáng)，此時加入外源保護(hù)物質(zhì)，可通過增強(qiáng)其他保護(hù)系統(tǒng)，會出現(xiàn)抗氧化酶活性較單獨脅迫降低的情況［40］。

4 結(jié)論

本試驗篩選了50 mmol/L NaCl 脅迫下黃瓜幼苗最適宜的NaHS濃度為200 μmol/L以及葉面噴施時間間隔為2 d，證實了H2S對黃瓜幼苗耐鹽性的調(diào)控作用。H2S 通過調(diào)控黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)，減少H2O2和MDA的積累，增加葉綠素、類胡蘿卜素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，維持PSII最大光化學(xué)效率，從而減少鹽脅迫對黃瓜幼苗的損傷。