陳李東,張學(xué)順,劉曉倩

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

補(bǔ)骨脂別名破故紙，是豆科草本植物補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實(shí)，性溫、味辛，歸腎、脾經(jīng)。具有補(bǔ)腎固精、縮尿止帶、溫脾止瀉、固沖安胎之功效[1-2]。臨床上有廣泛應(yīng)用，內(nèi)服主治腎虛冷瀉、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛等；外用主治皮膚病、白癜風(fēng)[3-4]等。近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，補(bǔ)骨脂還具有抗菌、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用[5]。

據(jù)《雷公炮炙論》記載補(bǔ)骨脂“性本大燥，毒”[6]，其久服有毒副作用，入藥前需經(jīng)過炮制[7]，以使其毒性明顯降低。補(bǔ)骨脂炮制方法較多，課題組前期的試驗(yàn)研究選取了具有代表性的15種炮制方法，采用高效液相法確定了酒焙法為補(bǔ)骨脂的最佳炮制方法。酒焙法的炮制工藝條件文獻(xiàn)記載較少，缺乏客觀的量化標(biāo)準(zhǔn)，易造成炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可能存在不規(guī)范性的問題。鑒于此，本試驗(yàn)以補(bǔ)骨脂中的有效成分(補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素[8])和有毒成分(補(bǔ)骨脂酚，具有肝腎毒性且具有較高細(xì)胞毒性[9-10])為考察因素，采用正交優(yōu)選試驗(yàn)[11]來優(yōu)化酒焙法炮制工藝條件，為補(bǔ)骨脂的炮制工藝規(guī)范化提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器 安捷倫1260分析型高效液相色譜儀；超聲波提取器(昆山市超聲儀器公司)；AB135-S型電子天平。

1.2 試藥 補(bǔ)骨脂藥材(購(gòu)于安國(guó)市任德興藥材有限公司，批號(hào)：1804002)；乙腈為色譜乙腈；甲醇為分析純；水(娃哈哈純凈水)；紹興黃酒(浙江塔牌公司)；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(購(gòu)于上海源葉公司，批號(hào):YJ07315A14)；異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(購(gòu)于上海源葉公司，批號(hào):R01A6F1)；補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品(購(gòu)于上海源葉公司，批號(hào):YM0316SB13)。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒制補(bǔ)骨脂的制備 取補(bǔ)骨脂9份，每份100 g，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)加炮制用黃酒悶潤(rùn)36 h，隨后置于烘箱中烘制。選擇藥酒比例(A)、烘制時(shí)間(B)、和烘制溫度(C)3 個(gè)因素，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)(因素水平見表1)?？紤]到試驗(yàn)中可能存在誤差的影響，每次試驗(yàn)平行3次。

表1 正交因素水平表

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，程序?yàn)椋?～8 min，20% A→40% A；8～18 min，40% A→70% A；18～21 min，70% A→85% A；21～30 min，85% A；30～32 min，20% A；流速0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取3種對(duì)照品0.82、0.78、1.96 mg，甲醇溶解并定容于50 mL棕色量瓶，制得混合對(duì)照品溶液，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品濃度分別為16.4、15.6、39.2 μg·mL-1。

2.2.3 供試品溶液制備 取樣品，粉碎，過60目篩，精密稱取各粉末1.0 g，置于索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流，提取2 h，冷卻，轉(zhuǎn)移到250 mL量瓶，加甲醇適量稀釋到刻度，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，取濾液，備用。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、8、12、18、30 μL，注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積值(Y)和進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚的回歸方程分別是Y=6 569.1X-3.835 7(R2=0.999 9)、Y=7 712X-4.332 4(R2=1)、Y=18 884X+3.205 3(R2=1)，進(jìn)樣量范圍分別在0.033～0.492 μg、0.031～0.468 μg、0.078～1.176 μg線性關(guān)系良好。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄混合對(duì)照品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚峰面積的精密度RSD分別為0.80%、0.75%、0.31%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，取“2.2.3”項(xiàng)下各供試品溶液5 μL，分別于24 h內(nèi)6次測(cè)定含量，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.6%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.12%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液平行試驗(yàn)5次記錄樣品的HPLC色圖譜，共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于1.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定含有量已知的藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密加入各對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各成分加樣回收率分別在99.34%～102.17%，RSD為0.67%～0.83%，表明該方法穩(wěn)定可行。

2.2.5 樣品測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下各炮制品，粉碎，過60目篩，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀分析測(cè)定。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選 采用綜合評(píng)分法對(duì)指標(biāo)性成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，將各指標(biāo)的最大值作為參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)同一指標(biāo)中數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理，處理公式：Dab=Xab/(Xb)max×100。其中Xab表示第a次試驗(yàn)中第b個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值，Dab表示第b個(gè)指標(biāo)的第a個(gè)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，a的取值范圍為1至9；b的取值范圍為1、2、3，設(shè)定評(píng)價(jià)總分為100分，對(duì)各炮制品的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚依次打分評(píng)價(jià)。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的Dab值設(shè)定為正值，補(bǔ)骨脂酚Dab值設(shè)為負(fù)值，綜合評(píng)分Y值是三者評(píng)分之和。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)表及綜合評(píng)分結(jié)果

表3 方差分析表

由直觀分析可知，各因素對(duì)酒焙法炮制工藝的影響順序?yàn)锳>B>C，方差分析表明因素A、B、C都對(duì)綜合評(píng)價(jià)總分Y值具有顯著性的影響，其中A因素影響最大。最佳炮制工藝條件定為A2B2C3，即每100 g補(bǔ)骨脂藥材，加15%的黃酒，烘制溫度140 ℃，烘制時(shí)間120 min。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取補(bǔ)骨脂藥材3份，按最佳炮制工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果測(cè)得3份炮制品有效成分含量均高于生品，毒性成分含量均低于生品，平行實(shí)驗(yàn)獲得的樣品的指標(biāo)性成分含量基本沒有差異，結(jié)果表明優(yōu)選的炮制工藝有很好的重現(xiàn)性，合理可行，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

補(bǔ)骨脂為傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用廣泛。近年來，有關(guān)補(bǔ)骨脂臨床不良反應(yīng)報(bào)道越來越多[12-15]，補(bǔ)骨脂的用藥安全問題亟待解決。補(bǔ)骨脂臨床多以炮制品入藥，本課題組前期研究結(jié)果顯示，酒焙法炮制補(bǔ)骨脂優(yōu)勝于其他炮制法。為進(jìn)一步探討酒焙法的炮制工藝，本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)加酒量、烘干溫度和烘干時(shí)間炮制出9份不同條件下的補(bǔ)骨脂的樣品。應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行指標(biāo)性成分含量情況的測(cè)定得到酒焙法炮制工藝的影響順序是藥酒比例>烘制時(shí)間>烘制溫度。確定了酒制補(bǔ)骨脂的最佳炮制工藝是補(bǔ)骨脂藥材100 g，加15%黃酒，烘制時(shí)間120 min，烘制溫度140 ℃。

單因素考察預(yù)試驗(yàn)結(jié)果提示黃酒的用量對(duì)補(bǔ)骨脂中指標(biāo)性成分有一定的影響，開始隨藥酒比例的增加而上升，當(dāng)藥酒比例達(dá)15%時(shí)，此時(shí)有效成分的含量最高，宋瀟等[16]報(bào)道，酒制補(bǔ)骨脂可在炮制過程中發(fā)生補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷向補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的轉(zhuǎn)化，可能因此引起有效成分的增加。但隨著藥酒比例的增大，二者的含量卻逐漸降低，推測(cè)悶潤(rùn)過程中，大量的黃酒起到了提取溶媒的作用，導(dǎo)致指標(biāo)性成分溶于黃酒[17]，造成指標(biāo)性成分含量的損失。補(bǔ)骨脂酚的含量隨酒藥比例的增加而降低，其中藥酒比例從5%到15%時(shí)補(bǔ)骨脂酚含量降低的幅度最大。雖然提高酒藥比例，可以降低補(bǔ)骨脂酚的含量，但對(duì)有效成分的損失較大。

在烘制過程中，烘制時(shí)間的長(zhǎng)短和烘制溫度的高低對(duì)補(bǔ)骨脂成分的變化也有一定影響。推測(cè)烘制激活了藥材中某些酶的活性，在一定烘制時(shí)間和溫度范圍內(nèi)，使得補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷向補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的轉(zhuǎn)化增加，引起有效成分的增加，同時(shí)因補(bǔ)骨脂酚具有揮發(fā)性[18]，隨著烘制的溫度升高及時(shí)間的延長(zhǎng)，該成分含量也隨之下降。

本試驗(yàn)分別比較了紹興黃酒、即墨黃酒、白酒及95%乙醇4種輔料對(duì)補(bǔ)骨脂藥材中指標(biāo)性成分的影響。通過試驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)紹興黃酒和即墨黃酒制備的炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量明顯高于白酒和乙醇，4種炮制輔料對(duì)補(bǔ)骨脂酚影響不太明顯，在紹興黃酒炮制品中補(bǔ)骨脂酚成分略低于其他3種炮制品，綜合考慮輔料對(duì)補(bǔ)骨脂中有效和有毒成分的影響，因此本試驗(yàn)采用紹興黃酒作為本試驗(yàn)炮制輔料用酒。

今后，本試驗(yàn)將考察補(bǔ)骨脂生品及不同炮制品對(duì)氫化可的松造腎陽(yáng)虛小鼠的治療作用，用于明確藥材炮制前后的藥效學(xué)變化，為其量效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。