李奇，田靜

(揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225001)

感冒疏風片由麻黃、苦杏仁、桂枝、白芍(酒炙)、紫蘇葉、防風、桔梗、獨活、甘草、大棗、生姜、谷芽(炒)12味中藥組成，具有辛溫解表，宣肺和中之功效，用于風寒感冒，發(fā)熱咳嗽，頭疼怕冷，鼻流清涕，骨節(jié)酸痛，四肢疲倦。方中桂枝發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽化氣，平?jīng)_降氣；酒白芍養(yǎng)血調經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽；防風祛風解表，勝濕止痛，止痙；甘草補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥[1]。感冒疏風片現(xiàn)行標準WS3-B-2251-96收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑(第11冊)》，無含量測定項[2]。現(xiàn)有質量相關文獻寥寥，且僅針對方中某一藥味的1～2種成分開展定量分析，不利于該制劑整體質量的控制[3-5]。因此，為了更好地控制感冒疏風片的內在質量，本試驗分別選取上述4味藥材中5個相關活性成分進行含量測定，首次采用波長切換高效液相色譜法同時測定該制劑中肉桂酸、芍藥苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷以及甘草酸的含量，為該制劑質量標準提高和其臨床用藥等效性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗材料與儀器

1.1 儀器 WATERS e2695型高效液相色譜儀，包括2998 PDA檢測器(美國Waters公司)；XS205DU十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；KH-400KD超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。Milli-Q Reference超純水儀(美國密理博)。

1.2 試劑與試藥 對照品芍藥苷(批號：110736-202044，純度96.8%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號：111523-201208，純度96.4%)、甘草苷(批號：111610-201607，純度96.4%)、肉桂酸(批號：110786-201604，純度98.8%)、甘草酸銨(批號：110731-201720，純度97.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純(迪馬公司)，其余試劑為分析醇(國藥集團化學試劑有限公司)，水為純化水，3批感冒疏風片(昆明中藥廠有限公司)，批號：490133(S1)、400146(S2)、400566(S3)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×4.6 mm，4 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脫 ，梯度洗脫條件見表1；流速1.0 mL·min-1；柱溫28 ℃；檢測波長：240 nm(0～14 min，檢測芍藥苷;25～30 min,檢測5-O-甲基維斯阿米醇苷)、275 nm(14～25 min，檢測甘草苷；30～40 min，檢測肉桂酸)、250 nm(40～70 min，檢測甘草酸)；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 取芍藥苷對照品、甘草苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品、肉桂酸對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含芍藥苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸1 028、169.1、61.31、19.27、308.2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取感冒疏風片樣品20片，研細，混勻，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，水浴加熱回流30 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按感冒疏風片處方比例，模擬制備工藝制成缺酒白芍、桂枝、防風、甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法分別制成陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液及缺桂枝、酒白芍、防風、甘草的陰性樣品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件分別進樣10 μL，結果見圖1。芍藥苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸與相鄰色譜峰的分離度均不低于1.5，陰性樣品如圖譜顯示其他成分對5個待測成分的測定均無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各精密吸取10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以對照品質量濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸分析，結果見表2?？芍鞒煞衷诟髯再|量濃度范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 取 “2.2.1”項下混合對照品溶液3 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果芍藥苷、甘草苷、甘草酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸峰面積RSD(n=6)分別為0.68%、0.63%、0.45%、0.64%、0.63%，表明儀器具有良好的精密度。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號：400566)，分別于室溫下放置0、2、8、16、24 h，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果芍藥苷、甘草苷、甘草酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸峰面積RSD(n=5)分別為1.1%、1.2%、1.4%、1.4%、1.1%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

A.對照品;B.供試品;C.缺防風陰性樣品;D.缺桂枝陰性樣品;E.缺酒白芍陰性樣品;F.缺甘草陰性樣品 1.芍藥苷;2.甘草苷;3.5-O-甲基維斯阿米醇苷;4.肉桂酸;5.甘草酸圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖

2.3.5 重復性試驗 取同一批感冒疏風片(批號：400566)樣品細粉6份，每份取約2 g ，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算含量。結果芍藥苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸的平均含量分別為5.977、0.558 8、0.279 2、0.107 7、1.187 mg·g-1，RSD分別為1.9%、1.1%、0.70%、1.9%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的感冒疏風片樣品(S3，批號：400566)約1 g，共6份，精密稱定，按100%水平精密加入混合對照品溶液(含芍藥苷1.056 6 mg·mL-1、甘草苷0.105 7 mg·mL-1、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.061 3 mg·mL-1、肉桂酸0.021 8 mg·mL-1、甘草酸0.222 5 mg·mL-1)5 mL，再精密加入甲醇20 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各成分的平均加樣回收率及RSD，結果芍藥苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸的平均加樣回收率(n=6)分別為101.0%(RSD=1.0%)、98.2%(RSD=1.8%)、101.8%(RSD=1.5%)、96.8%(RSD=1.5%)及100.2%(RSD=1.4%)，詳見表3。

表3 感冒疏風片5個成分的加樣回收率試驗結果(n=6)

表3(續(xù))

2.4 樣品測定 取3批感冒疏風片樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，按外標法計算樣品中芍藥苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸的含量，結果見表4。

表4 樣品中5種成分的含量測定結果(mg·g-1)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本試驗采用DAD檢測器對5個目標化合物在190～400 nm波長處掃描，結果芍藥苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、肉桂酸、甘草酸分別在232、275、232、277、252 nm波長處有最大吸收。為了保證各成分均有合適的靈敏度、分離度，并綜合考慮成分的含量以及雜質干擾因素，最終選擇波長切換模式。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 在選擇流動相體系時，參考相關文獻[6-10]，摒棄了甲醇體系，考察了乙腈-0.05%磷酸和乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)，結果在乙腈-0.05%磷酸體系下，芍藥苷、甘草苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷化合物峰形略拖尾，且乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)分離度更高，故選擇乙腈-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫。

3.3 供試品制備的優(yōu)化 本試驗考察了不同提取方式(加熱回流、超聲提取)、不同提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、不同提取時間(15、30、60 min)，試驗結果表明，加熱回流優(yōu)于超聲提取；以甲醇作為提取溶劑時各目標成分提取量最高；回流提取30 min時，各成分已基本提取完全。最終確定“2.2.2”項供試品溶液制備方法。

3.4 小結 本試驗建立了采用高效液相色譜法同時測定感冒疏風片中5個指標成分含量的分析方法，涵蓋了處方中君臣佐使中的4個藥味，較全面地反映了該制劑的質量，該方法簡單、可靠、效率高、專屬性好，可為感冒疏風片質量標準的提高提供依據(jù)。