袁名揚，周學剛，扈丹丹，蔣蕾，楊波*，彭海生*

(1.哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)藥學院，黑龍江 大慶 163319)

乳腺增生病(mammary gland hyperplasia，MGH)，也稱乳腺增生癥，是一種非炎性非腫瘤性疾病，是最常見的乳腺疾病[1]。乳腺增生好發(fā)于中年女性[2]，常表現(xiàn)為乳房腫塊疼痛和乳腺摸到結(jié)節(jié)，近些年發(fā)病率有越來越低齡化的趨勢。乳腺增生發(fā)病因素錯綜復雜，在中醫(yī)屬于“乳癖”范疇，與肝氣郁結(jié)、氣血瘀滯密切相關?，F(xiàn)代醫(yī)學則認為，乳腺增生的主要病因是下丘腦-垂體-卵巢軸內(nèi)分泌功能失調(diào)引起的。由于疼痛反復和治療周期漫長，乳腺增生已經(jīng)嚴重的影響患者的身心健康，甚至影響到工作和生活。

西醫(yī)對于乳腺增生的治療主要采用內(nèi)分泌藥物治療或手術(shù)治療方案，但效果不理想，且有副作用[3]。通過目前臨床研究，治療乳腺增生常用中醫(yī)療法，且中醫(yī)療法具有療效好、毒副作用小、患者易于接受等優(yōu)點[4]。逍遙散(柴胡、當歸、白芍、茯苓、白術(shù)、甘草)是乳腺增生治療應用最廣泛的中醫(yī)方劑，很多治療乳腺增生的方劑以其作為基礎方加減而成。其中柴胡作為其君藥，同時也是治療乳腺增生用藥中出現(xiàn)頻次最多、比例最大的單味藥，具有行氣疏肝的作用；當歸作為臣藥，具有養(yǎng)血柔肝的功效。柴胡、當歸在中藥治療乳腺增生的用藥的組合使用頻次較高[5]，二者聯(lián)用，可疏肝解郁，使肝條達、疏泄，以達舒肝散郁，祛邪而不傷正之效。然而，目前對“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生的活性成分研究較少，作用機制尚不明確。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學，構(gòu)建“藥對-活性成分-靶點-疾病”等網(wǎng)絡，獲得藥物作用于乳腺增生的潛在作用靶點，并在GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫進行富集分析，預測其關鍵通路，深入探討藥對與疾病的關系，揭示“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生的潛在作用機制，為臨床治療乳腺增生提供新思路，同時也為進一步臨床試驗和基礎研究奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 “柴胡-當歸”藥對活性成分及靶點蛋白的篩選 將“柴胡”和“當歸”作為關鍵詞，利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https://tcmsp-e.com)，分別搜索其主要化學成分；篩選口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18[6-7]的活性化合物，獲得活性成分，并提取活性成分對應的蛋白質(zhì)靶點。OB是口服藥物進入系統(tǒng)循環(huán)轉(zhuǎn)運有效性評價的重要指標，OB數(shù)值越高代表藥物生物活性分子的DL越好[8]。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，將獲得的靶點進行標準化。

1.2 乳腺增生相關靶點的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以 “Mammary gland hyperplasia” OR “MGH” 為關鍵詞檢索與乳腺增生疾病相關的靶點基因。

1.3 藥對-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)獲得“柴胡-當歸”藥對活性成分與乳腺增生的交集靶點，作為潛在作用靶點。將潛在作用靶點通過Cyto-scape 3.6.0軟件構(gòu)建藥對-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡圖。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構(gòu)建 將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，將蛋白種類設定為“Homo snpiens”，根據(jù)相互作用最佳可視化分析，設置最小相互作用閾值設定為 “Highest confidence> 0.7”，去除游離蛋白質(zhì)，其余設置均為默認，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖，下載csv格式文件，通過Cytoscape 3.6.0軟件進行調(diào)整。

1.5 分子對接分析活性成分與靶蛋白的結(jié)合作用 基于“1.4”項下所述PPI網(wǎng)絡，篩選度值排名前5位的靶標，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org/)下載其對應蛋白，保存為pdb文件。在TCMSP中下載“柴胡-當歸”藥對主要活性成分的結(jié)構(gòu)，并保存成mol2文件。然后采用Mgltools 1.5.6軟件，去水加全氫，分離配體與受體，并保存為pdbqt文件。通過Autodock Vina 1.1.2將配體與受體進行對接，通過對接結(jié)果分析“柴胡-當歸”藥對活性成分與核心靶標之間的結(jié)合活性。若結(jié)合能 ≤-5.0 kcal·mol-1，則表明配體與受體之間可以結(jié)合；若結(jié)合能 ≤-7.0 kcal·mol-1，則表明配體與受體之間具有較好的親和力[9]。分析結(jié)果后，取核心靶標與活性成分結(jié)合活性打分最高的構(gòu)象用PyMol軟件進行分析作圖。

1.6 交集基因的富集分析 借用RStudio軟件對交集基因進行GO分析和KEGG通路富集分析。篩選P<0.05[10]的生物學過程與通路，再選取靶標富集數(shù)量最多的前10條生物學過程與前30條通路，綜合相關研究文獻篩選出可能與治療乳腺增生相關的通路，作為該藥對治療乳腺增生的關鍵通路。

1.7 活性成分-關鍵靶點-關鍵通路網(wǎng)絡的構(gòu)建 通過Cytoscape3.6.0構(gòu)建活性成分-關鍵靶點-關鍵通路等多層次網(wǎng)絡圖，利用其中的Network Analyzer插件對自由度(Degree)等相關參數(shù)對網(wǎng)絡圖進行分析。

2 結(jié)果

2.1 “柴胡-當歸”藥對活性成分篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共獲得柴胡活性成分17種、當歸活性成分2種，合并去重后共獲得活性成分18種，豆甾醇為二者共同成分，詳見表1。

表1 “柴胡-當歸”藥對活性成分信息

2.2 乳腺增生相關靶點檢索結(jié)果 共獲得乳腺增生相關靶點4 371個。

2.3 藥對-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡的分析結(jié)果 通過Draw Venn Diagram在線工具繪制韋恩圖(見圖1)共獲得“柴胡-當歸”藥對活性成分靶點與乳腺增生靶點的交集基因150個。將上述交集基因?qū)隒ytoscape 3.6.0軟件中，構(gòu)建藥對-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡圖(見圖2)。從該網(wǎng)絡圖中可以看出，該網(wǎng)絡含節(jié)點共163個(1個疾病節(jié)點、2個藥材節(jié)點、10個活性成分節(jié)點、150個靶點節(jié)點)，317條邊。其中疾病用黃色表示，“柴胡-當歸”藥對用綠色表示，活性成分用粉色表示，潛在作用靶點用藍色表示。

圖1 “柴胡-當歸”藥對活性成分與MGH交集基因的韋恩圖

圖2 藥對-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡圖

2.4 “柴胡-當歸”藥對活性成分與乳腺增生交集基因PPI網(wǎng)絡 PPI網(wǎng)絡圖見圖3。該網(wǎng)絡含150個節(jié)點與1 167條邊?！安窈?當歸”藥對可能通過白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤蛋白p53(TP53)、蛋白激酶(AKT1)及血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)等關鍵靶點發(fā)揮治療乳腺增生的作用。

圖3 “柴胡-當歸”藥對靶蛋白PPI網(wǎng)絡

2.5 活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果 通過靶標相互作用網(wǎng)絡中度值排名前五的關鍵靶標AKT1、TNF、TP53、VEGFA、IL-6，將其與“柴胡-當歸”藥對的18個活性成分做分子對接驗證，統(tǒng)計活性成分數(shù)目，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，AKT1與15個活性成分結(jié)合親和性為較強或很強，TNF有17個、TP53有11個、VEGFA有13個、IL-6有11個，由此可見“柴胡-當歸”藥對的活性成分與核心靶標具有較強的結(jié)合能力。核心靶標與活性成分結(jié)合活性打分最高的構(gòu)象用PyMol軟件進行分析后，見圖4。

表2 活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 通過RStudio軟件對交集基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到GO條目2 432個(P<0.05)，生物過程(BP)2 233個、細胞組成(CC)39個、分子功能(MF)160個，根據(jù)富集靶標數(shù)量由多到少進行排序，其中富集基因數(shù)排序前10位的GO分析結(jié)果見表3～5。KEGG根據(jù)P<0.05篩選得到170條通路，通路富集分析結(jié)果(前30位)見圖5。

a.AKT1與豆甾醇；b.TNF與α-菠菜甾醇；c.TP53與α-菠菜甾醇；d.VEGFA與豆甾醇；e.IL-6與豆甾醇圖4 活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果圖

表3 GO富集分析-分子功能

表4 GO富集分析-細胞組成

表5 GO富集分析-生物過程

圖5 “柴胡-當歸”藥對治療MGH的KEGG通路

經(jīng)GO和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，“柴胡-當歸”藥對治療MGH的分子功能主要包括細胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合等；生物過程主要包括活性氧代謝、氧化應激反應等；細胞組分主要包括膜區(qū)、細胞質(zhì)膜筏等；信號通路主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等。

2.7 活性成分-關鍵靶點-關鍵通路網(wǎng)絡構(gòu)建 綜合閱讀文獻與KEGG分析結(jié)果，選出可能與MGH相關的通路，構(gòu)建活性成分-關鍵靶點-關鍵通路網(wǎng)絡圖，詳見圖6。其中三角形代表關鍵通路，箭頭形狀代表關鍵靶標，六邊形代表活性成分。

圖6 活性成分-關鍵靶標-關鍵通路網(wǎng)絡

由圖6可見，“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生是由多個活性成分、多個靶標及多個通路共同作用的過程。其中，與關鍵通路有關的活性成分有矮牽牛素、山柰酚、槲皮素、3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黃酮等；關鍵靶標有IL-1、EGF、E2F、CCL2、IL-6等；通路主要涉及內(nèi)分泌耐藥、MAPK信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。

3 討論

本研究通過“活性成分-關鍵靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建，獲得與乳腺增生有關的活性成分為槲皮素、山柰酚、矮牽牛素及3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黃酮等。其中槲皮素、山柰酚及3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黃酮均為黃酮類成分，黃酮類化合物具有保護肝臟的效能，還具有類雌激素或抗雌激素作用[11]。雌激素在乳腺增生發(fā)展中起到重要的作用，可以通過影響生長因子的合成來促進乳腺細胞增殖，而黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)雌激素代謝基因的表達，減少雌激素代謝物的產(chǎn)生，如槲皮素可以發(fā)揮抗雌激素效應，高濃度時能抑制乳腺上皮細胞存活[12]，從而起到治療乳腺增生的作用。

PPI拓撲學分析結(jié)果顯示，AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等靶點度值較大，是“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生潛在核心靶點。AKT1是一種參與細胞存活和細胞周期調(diào)控的靶點，乳腺增生的延遲退化與在AKT1中的Thr308位點磷酸化增加有關。數(shù)據(jù)表明，AKT1還參與調(diào)控哺乳期乳腺細胞的生長[13]。TP53位點處于p53基因的內(nèi)含子中，有穩(wěn)定基因組、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、抑制細胞周期進展、促進凋亡等作用。P53可以通過蛋白降解調(diào)控Spy1蛋白的表達，p53的突變或消失會使Spy1水平提高，從而導致乳腺增生[14]。細胞生長增殖需要從血管中獲得營養(yǎng)，乳腺組織增生過度也需新血管生成來供應營養(yǎng)。VEGFA與其受體通過旁分泌途徑協(xié)同調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞分化和血管生成，刺激血管生成促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，VEGFA的表達隨著增生程度的加重而增加[15]。“柴胡-當歸”藥對可以降低VEGFA的表達，抑制乳腺增生組織新生血管形成，從而治療乳腺增生。炎性因子TNF可以通過降低氧化應激反應相關蛋白8-OHdG和NT的表達，來緩解乳腺增生炎癥和氧化應激反應，“柴胡-當歸”藥對可能是通過調(diào)節(jié)TNF的表達，增強免疫功能，從而起到緩解乳腺增生的作用[16]。

綜合GO和KEGG分析以及既往研究發(fā)現(xiàn)，“柴胡-當歸”藥對可能通過IL-7信號通路、TNF信號通路、內(nèi)分泌耐藥、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等實現(xiàn)對乳腺增生的治療作用。KEGG通路圖顯示，IL-17信號通路通過NF-κB信號通路、MAPK信號通路調(diào)控乳腺增生的治療。IL-17信號通路可以激活NF-κB或者增加IL-6的分泌，發(fā)揮其促炎癥作用，使COX-2表達增加，引起組織增生[17]。同時，IL-1β、IL-6、IFN-γ與TNF-α等在MAPK信號通路中通過協(xié)同作用在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，可以增強免疫力，起到緩解乳腺增生的效能。TNF信號通路可以通過巨噬細胞分泌的TNF-α影響VEGF的表達，影響乳腺組織新血管的生成，但表達途徑尚不明確；也可能通過泛素-蛋白酶體途徑介導的蛋白水解過程，激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1或者IKβ激酶，激活NF-κB的活性，誘導負性凋亡調(diào)節(jié)因子，從而促進乳腺組織細胞的增殖。HER2是介導乳腺增生內(nèi)分泌耐藥的一個重要的生長因子受體，生長因子受體與ER信號通路彼此串話，雙向調(diào)節(jié)，可以共同刺激乳腺細胞[18]。KEGG分析結(jié)果表明PI3K-Akt信號通路與內(nèi)分泌耐藥有關，有研究證明，通過抑制PI3K或AKT的活性可以增強ER表達，影響內(nèi)分泌耐藥效果，從而治療乳腺增生[19]。MAPK信號通路可能通過參與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、炎癥反應和氧化應激反應來起到治療乳腺增生的效用[20]，主要包括ERK1/2、JNK、P38和ERK5四條通路。MAPK信號通路被證實可以調(diào)節(jié)雌激素和黃體酮的受體ER和PR[21]，影響乳腺細胞的增殖。ER和HER-2信號通路相互作用，也會激活MAPK信號通路，誘導ER磷酸化，促進乳腺細胞增殖[22]。HIF-1信號通路是一種缺氧適應性信號通路，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞周期等過程，還可以調(diào)控免疫反應、新血管的生成等，增加組織的缺氧耐受力。主要靶點為HIF-1α，低氧時HIF-1α的穩(wěn)定性會增加。HIF-1通路和其他信號通路的交叉調(diào)節(jié)對乳腺增生的治療起到很好地效能。缺氧時，細胞內(nèi)ERK發(fā)生磷酸化，促進HIF-1的表達，因而可以推斷MAPK信號通路可以調(diào)控HIF-1的表達從而共同治療乳腺增生，但其機制仍需要進一步研究[23]。此外，HIF-1信號通路還與NF-κB介導的炎癥信號通路有一定的相關性，炎癥刺激因子可以通過調(diào)控NF-κB介導的炎癥信號通路來增加HIF-1基因和蛋白水平的表達，調(diào)節(jié)炎癥反應，從而發(fā)揮抗乳腺增生的效能[24]。

綜上所述，“柴胡-當歸”藥對可能通過調(diào)節(jié)AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等核心靶點，參與IL-7信號通路、TNF信號通路、內(nèi)分泌耐藥、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等途徑，從而調(diào)控細胞的氧化應激反應、炎癥反應、抗新血管生成、細胞增殖和凋亡等過程，起到治療乳腺增生的作用。本研究所得結(jié)論大部分與現(xiàn)有研究報道相符合，進一步地證明了網(wǎng)絡藥理學與中藥研究的結(jié)合，可以挖掘中醫(yī)藥治療疾病的作用機制，同時也為中藥研發(fā)提供理論支撐。然而，本研究結(jié)果只是對“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生作用機制的預測，僅僅停留在生物信息分析層面，具體靶點和通路間的作用機制還需要進一步的實驗去驗證，從而為乳腺增生治療藥物的研發(fā)提供方向和依據(jù)。