王麗萍，侯佳影，周 君，于文清，劉清華

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院昌吉分院內(nèi)分泌科，新疆 昌吉 831100；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆 石河子 832008)

原發(fā)性肝癌(PHC)主要包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌和兩者混合型這三種不同病理學(xué)類型。病因分型有病毒相關(guān)性肝癌、酒精性肝癌、非酒精性脂肪肝病性肝癌及其他不明原因性肝癌；肝細(xì)胞癌(HCC)占PHC的75%～85%[1]。PHC是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、發(fā)病率高、死亡率高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)及生存期短的特點(diǎn)，發(fā)病率及死亡率在全球分居第六和第三，在我國(guó)分居第四和第二，僅次于肺癌，嚴(yán)重威脅人民的生命健康[2]。肝癌早期癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已是中晚期，手術(shù)機(jī)會(huì)僅20%～30%，且術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%～70%，因此，肝癌的早期診斷對(duì)治療及預(yù)后具有十分重要的意義[3]。目前廣泛運(yùn)用于臨床診斷的方法是血清甲胎蛋白(AFP)測(cè)定和彩超檢查(US)。雖然血清AFP對(duì)PHC的診斷起著重要的作用，但在診斷中存在一定的假陰性。研究報(bào)道肝癌患者的AFP陽(yáng)性率在60%～70%[4]，而且在胃癌、卵黃囊腫瘤等其他惡性腫瘤中也存在增高現(xiàn)象[5-6]，因此單一的診斷方式存在一定的局限性，故尋找新的高效的腫瘤標(biāo)志物成為亟待解決的問(wèn)題。血清胞苷尿苷鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白(CUGBP)1是RNA結(jié)合蛋白質(zhì)CELF家族的一員，在細(xì)胞核中通過(guò)影響非連續(xù)外顯子的保留或刪除而調(diào)節(jié)mRNA前體的選擇性剪接，在細(xì)胞質(zhì)中，CUGBP1通過(guò)結(jié)合到靶向mRNA的特定序列而調(diào)節(jié)mRNA的翻譯或降解，此外，CUGBP1還可通過(guò)RNA編輯酶而調(diào)節(jié)mRNA的編輯[7]。CUGBP1在機(jī)體基因轉(zhuǎn)錄與蛋白翻譯過(guò)程中都有重要作用，CUGBP1失調(diào)會(huì)導(dǎo)致一系列的病理生理改變，CUGBP1在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯以及代謝過(guò)程中起到重要作用[8]。近年研究表明CUGBP1與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有研究顯示CUGBP1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中過(guò)表達(dá)，從而上調(diào)β-連環(huán)蛋白和波形蛋白水平，因此影響上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9-10]。CUGBP1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。CUGBP1作為一種剪接因子，在肝癌中與胰島素受體A的表達(dá)密切相關(guān)，胰島素受體A可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程[11]。通過(guò)對(duì)人肝母細(xì)胞瘤樣本做RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)CUGBP1的表達(dá)明顯減低[12]。CUGBP1在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著特定的作用，其表達(dá)規(guī)律也可能為肝癌診斷提供新方法，然而，CUGBP1在血液中表達(dá)水平探究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討CUGBP1在PHC中的表達(dá)水平及診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象：收集2018年8月～2019年8月就診于本院腫瘤內(nèi)科、體檢科、感染性疾病科和消化內(nèi)科等相關(guān)科室體檢健康者、慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化及PHC患者，共150例。其中男90例(60%)，女60例(40%)，年齡(55.2±7.99)歲。此研究已獲得石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且試驗(yàn)對(duì)象對(duì)本次研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的慢性乙型病毒性肝炎感染史；②肝功能較好(Child-pugh分級(jí)A級(jí)或B級(jí))；③依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》(2019年版)通過(guò)影像學(xué)檢查或病理學(xué)檢查診斷為原發(fā)性肝癌；④符合我國(guó)2019年《慢性乙型肝炎防治指南》或美國(guó)移植學(xué)會(huì)(AST)實(shí)踐委員會(huì)發(fā)布2019年2月《病毒性肝炎指南》中肝硬化/慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑤不伴有其他惡性腫瘤；⑥患者依從性好且自愿參加臨床試驗(yàn)，有完整的病歷資料。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝功能較差(Child-pugh分級(jí)為C級(jí))或伴有大量腹水；②合并有其他類型肝炎或有急慢性炎性反應(yīng)/泌尿系感染；③伴有其他惡性腫瘤； ④繼發(fā)性肝癌；⑤研究者認(rèn)為不適宜的其他情況或病歷資料書(shū)寫不完整，依從性差，不愿意參與臨床研究。

1.3人口學(xué)基本情況：本研究共收集受檢者150例，其中慢性乙型肝炎36例，男22例，女14例，年齡46～65歲，平均(52.42±6.09)歲；肝炎后肝硬化39例，男23例，女16例，年齡45～70歲，平均(55.41±7.85)歲；乙肝相關(guān)性PHC 43例，男27例，女16例，年齡41～71歲，平均(56.60±8.72)歲；對(duì)照組為32例健康體檢者，男18例，女14例，年齡34～68歲，平均(56.19±8.57)歲。肝癌組與健康體檢組、乙肝及肝硬化組間年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.4方法

1.4.1樣本采集及處理：采集研究對(duì)象空腹外周靜脈血5 ml置于肝素鋰抗凝管中，室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min(3 000 r/min)，收集上清液分裝于EP管中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存；無(wú)RNA酶滴管取中間層白色部分于無(wú)酶EP管內(nèi)，再用無(wú)RNA酶管加1 ml Trizol試劑，混勻后保存在-80℃超低溫冰箱。

1.4.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清CUGBP1的表達(dá)情況：ELISA試劑盒購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)由1～2名實(shí)驗(yàn)員在同一條件，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)CUGBP1標(biāo)準(zhǔn)品，5倍比稀釋測(cè)得的OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算患者血清標(biāo)本中CUGBP1濃度。

1.4.3qRT-PCR檢測(cè)PWBC中CUGBP1基因的表達(dá)情況：收集的外周血白細(xì)胞(PWBC)中加入500 μl Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Bimake公司，每10 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系含總RNA 600 ng。qRT-PCR分析采用SYBR Green rRT-PCR試劑盒，引物序列CUBGP1(正義鏈：5'-GCCAACCTGTTCATCTACCACCTG-3'，反義鏈：5'-GGCAGACACGACATTCCCAAAGG-3')反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。β-actin(引物長(zhǎng)度=144 bp，正義鏈：5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，反義鏈：5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3')作為內(nèi)參，定量RT-PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行了分析。

2 結(jié)果

2.1各組血細(xì)胞計(jì)數(shù)與肝功能情況：體檢健康組、乙型肝炎組、肝硬化組及肝癌組的血細(xì)胞計(jì)數(shù)中，與體檢健康組比較，乙型肝炎組中性粒細(xì)胞百分比(N%)降低， 肝硬化組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)均減少，肝癌組PLT減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。與乙型肝炎組比較，肝硬化組與肝癌組PLT降低，N%增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

肝功能檢測(cè)中，與體檢健康組比較，乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組白蛋白(ALB)明顯減少，乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的血清濃度明顯增加，肝硬化組低于乙型肝炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)與堿性磷酸酶(ALP)濃度在肝癌組明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乙型肝炎組、肝硬化組高于體檢健康組，差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組肝功能比較[M(Q1，Q3)]

2.2各組AFP、CUGBP1、癌胚抗原(CEA)、CA199水平比較：血清CUGBP1在乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組等肝病組中的表達(dá)水平低于體檢健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，在乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組等肝病組之間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血清AFP在肝癌組的表達(dá)水平高于其他三組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，在乙型肝炎組、肝硬化組及體檢健康組中表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血清CA199在肝癌組、乙型肝炎組、肝硬化組中的表達(dá)水平高于體檢健康組，肝癌組高于乙型肝炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清CA199在肝癌組表達(dá)水平高于乙型肝炎組和肝硬化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清CEA在四組之間的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199水平比較[M(Q1，Q3)]

2.3血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC臨床診斷價(jià)值：以臨床確診為依據(jù)，考察各項(xiàng)血清學(xué)的單項(xiàng)與聯(lián)合診斷的靈敏度與特異度。血清AFP對(duì)肝癌的診斷靈敏度與特異度分別為69.8%、87.9%，在血清CUGBP1的檢測(cè)中，在約登指數(shù)為0.272時(shí)，測(cè)得敏感度和特異度分別為72.1%和60.7%，繪制ROC曲線，AUC=0.628 5。血清AFP、CEA、CA199、CUGBP1聯(lián)合檢測(cè)診斷敏感度95.3%，均高于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4～6，見(jiàn)圖1。

表4 各組血清 AFP、CUGBP1、CEA、CA199單項(xiàng)及聯(lián)合診斷陽(yáng)性數(shù)比較[n(%)]

表5 AFP、CUGBP1、CEA、CA199對(duì)PHC診斷效能評(píng)價(jià)

2.4各組PWBC中CUGBP1基因表達(dá)水平：CUGBP1基因在肝癌組中的表達(dá)水平(0.67±0.29)低于體檢健康組(1.00±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CUGBP1基因在乙型肝炎組(0.82±0.16)、肝硬化組(0.84±0.34)、體檢健康組之間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5CUGBP1在AFP陰性PHC中的診斷價(jià)值：在PHC中，存在一部分患者AFP檢測(cè)陰性，從而降低患者的臨床檢出率。在本研究肝癌組中有13例患者表現(xiàn)AFP陰性，通過(guò)檢測(cè)AFP陰性患者CUGBP1的表達(dá)，并繪制ROC曲線，AUC=0.628 1，結(jié)果表明血清CUGBP1在AFP陰性患者中也有一定的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖2。

表6 血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199在PHC中的ROC曲線情況

圖1 血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199用于診斷PHC的ROC曲線

圖2 AFP陰性PHC患者中，血清CUGBP1用于診斷PHC的ROC曲線

3 討論

PHC具有發(fā)生率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高和診斷率低等特點(diǎn)，手術(shù)治療是早期肝癌的首要治療方法，但由于其早期發(fā)病隱匿，大多數(shù)肝癌診斷時(shí)已經(jīng)是中晚期，錯(cuò)過(guò)手術(shù)最佳時(shí)機(jī)[13]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷以及早治療是提高肝癌患者生存率的關(guān)鍵。目前，臨床用于肝癌早期診斷的血清標(biāo)志物較少，臨床公認(rèn)的主要是AFP[14]。由于肝癌發(fā)生時(shí)肝細(xì)胞幼稚化明顯增加，原本胚胎時(shí)期表達(dá)AFP再次出現(xiàn)表達(dá)增高，從而在血清學(xué)上能檢測(cè)出肝癌特異性標(biāo)志物，但AFP陽(yáng)性率有限，容易出現(xiàn)漏診[15]。因此，本研究試圖尋找靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)便的血清標(biāo)志物，結(jié)合現(xiàn)有的檢測(cè)手段，為肝癌的早期診斷提供新方法。

RNA結(jié)合蛋白CUGBP1此前已經(jīng)研究報(bào)道參與調(diào)節(jié)肝臟的多個(gè)過(guò)程，包括出生后肝臟分化[16]，手術(shù)后肝臟增殖[17]以及損傷后肝臟恢復(fù)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，CUGBP1在肝癌的診斷中其敏感度高于目前臨床運(yùn)用中較多的分子標(biāo)志物如AFP、CA199及CEA，結(jié)合多個(gè)分子標(biāo)志物，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)的方式能明顯增加肝癌的診斷靈敏度。在AFP陰性肝癌患者中，CUGBP1仍具有診斷價(jià)值，因此可為AFP陰性患者的診斷提供新的途徑。眾所周知，癌癥的發(fā)生是通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)修飾水平的基因表達(dá)來(lái)改變肝臟的生物學(xué)過(guò)程，因此，CUGBP1作為CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β和組蛋白脫乙?；?HDAC)1翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要的調(diào)節(jié)作用[19-20]。有研究表明CUGBP1對(duì)肝癌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，敲除CUGBP1基因的小鼠肝癌發(fā)生明顯增加，預(yù)后更差,其抑制腫瘤的機(jī)制可能通過(guò)Ser302的去磷酸化從而激活CUGBP1的翻譯活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者中，血清CUGBP1的表達(dá)明顯減低，PWBC中CUGBP1基因的表達(dá)水平也明顯降低，與之前研究報(bào)道CUGBP1在小兒肝癌中明顯降低基本相一致。在血清CUGBP1檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎及肝硬化患者中也出現(xiàn)不同程度的減低，可能是由于肝疾病中肝細(xì)胞的功能與代謝的紊亂，從而對(duì)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一定的影響。肝損傷與肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，癌性錨蛋白重復(fù)序列蛋白(Gank)能結(jié)合并觸發(fā)CUGBP1去磷酸化，還能夠?qū)е翪UGBP1在細(xì)胞質(zhì)中被泛素化并隨后降解，所以在肝病不同病例階段時(shí)也會(huì)出現(xiàn)CUGBP1的減低[21]。

本研究通過(guò)CUBGP1及AFP等其他腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合診斷，結(jié)果表明聯(lián)合診斷很大程度上提高了肝癌的診斷敏感度。但鑒于目前早期肝癌檢測(cè)難度大、癥狀不明顯、惡性程度高等特點(diǎn)，較高敏感度的檢測(cè)手段具有一定的價(jià)值，可為患者起到提示作用，并能降低漏診率，有助于肝癌早期診斷。本研究發(fā)現(xiàn)CUGBP1基因在肝癌患者PWBC中表達(dá)明顯減低，乙型肝炎、肝硬化患者與健康體檢組表達(dá)無(wú)明顯差異。因此，綜合分析血清學(xué)CUGBP1的表達(dá)水平與PWBC中CUGBP1的基因表達(dá)，對(duì)肝癌的早期診斷具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

綜上所述，血清CUGBP1在肝癌患者中表達(dá)明顯減低，在PWBC中CUGBP1基因表達(dá)也明顯的減低，提示CUGBP1與肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。因此結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)與基因表達(dá)水平，表明CUGBP1可作為肝癌的潛在腫瘤標(biāo)記物。同時(shí)結(jié)合AFP、CEA、CA199等腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)，可提高肝癌早期診斷敏感度，降低漏診率，具有較好的輔助診斷價(jià)值。