張 姚,譚 琦,戴垠坤

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 長沙 410000)

在危及到人類健康的眾多疾病當(dāng)中,缺血性心臟病是較為常見的,讓血流恢復(fù)再灌注是最根本的治療方法。但是當(dāng)恢復(fù)血流再灌注之后,患者卻面臨著更嚴(yán)重的心肌損傷情況,人們稱此種情況為心肌缺血再灌注損傷(IRI)。當(dāng)前在醫(yī)療技術(shù)得到快速發(fā)展的情況下,臨床上也開始應(yīng)用各種新的治療方法和技術(shù)[1]。其中中藥對于IRI疾病的干預(yù)相關(guān)研究也吸引了不少學(xué)者的關(guān)注。在本次研究中就分析了加味丹參飲在IRI疾病中的干預(yù)效果,并分析干預(yù)中Nrf2-ARE信號通路所發(fā)生的改變。

1 資料與方法

1.1一般資料：納入30只雄性、性成熟的家兔,清潔級。家兔體重20～30 g。研究中需要使用到的試劑主要有：免疫熒光化學(xué)試劑、一抗、二抗、水合氯醛、萊菔硫烷(Nrf2激活劑)等。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2方法:將30只家兔劃分為三組,每組有10只。

1.2.1空白組：需要與模型組的家兔一樣,注射等量的0.9%NaCl溶液，完成開胸和冠脈穿線不結(jié)扎等。

1.2.2模型組：在兔耳緣靜脈,連續(xù)20 d注射去甲腎上腺素,具體注射劑量為0.1 mg/(kg·d)。在完成造模的第2天,需要注射250 mg/kg牛血清白蛋白。每10天注射1次,共注射2次。以空白組為標(biāo)準(zhǔn),對比兩組血流變學(xué)指標(biāo),當(dāng)模型組的這一指標(biāo)明顯高于空白組,即表示建模成功。

1.2.3干預(yù)組：需要按照成人的使用藥量,以動物的具體體重等完成換算。該組需要讓實驗兔完成灌胃給藥。在開胸之前的3 d,向胃部灌入10 ml/(kg·d)加味丹參飲。這一藥物中包含的中藥具體有：黃芪、丹參各20 g,赤芍10 g,川芎、紅花、當(dāng)歸、檀香等各6 g，還需要12 g的生地黃。將這些藥材進(jìn)行浸泡和煎煮、濃縮之后,保存好，為之后的應(yīng)用做好準(zhǔn)備。另外還需要讓本組家兔以腹腔給藥的方式,接受1 mg/kg的Nrf2激活劑藥物服用。在手術(shù)之后,1次/d。

1.3評判指標(biāo)：需要對比不同組別中家兔的Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)和凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.3.1Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)檢測方法：采用組織免疫熒光檢測方法進(jìn)行檢測。首先,對心肌組織切片采取冰凍措施,接受PBS漂洗。完成3次,5 min/次漂洗后,在丙酮當(dāng)中固定30 min左右。然后,漂洗后要采用0.25%的Triton液進(jìn)行15 min的破膜；再采用濃度為10%的BSA進(jìn)行60 min的封閉。之后開展孵育一抗、二抗,DAPI染色等。在顯微鏡下對陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行觀察。再觀察100倍視野下,從5個不同視野觀察心肌缺血再灌注病灶周圍情況。最后在借助于Optpro方法進(jìn)行成像分析。

1.3.2檢測心肌細(xì)胞凋亡方法：選取研究對象左心室位置的心肌細(xì)胞,大小為27 mm3左右,使用濃度為4%的多聚甲醛進(jìn)行固定。還需要分別使用梯度乙醇、二甲苯、石蠟等完成脫水、透明和包埋,最終進(jìn)行切片。所選擇的檢測方法為末端探針標(biāo)記方法。凋亡陽性細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)為：在細(xì)胞核中觀察到棕黃色的顆粒物。圖像分析方法：針對陽性表達(dá)情況,開展半定量分析。在分析凋亡細(xì)胞數(shù)量時,還要借助于彩色病理圖像來完成,選擇多種結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果：三組研究對象在第3天和第5天的Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果,從表中數(shù)據(jù)看出,干預(yù)后的第3天和第5天,空白組免疫雙標(biāo)陽性細(xì)胞分別是(10.0±1.0)個和(11.0±1.0)個；干預(yù)組統(tǒng)計結(jié)果分別為(26.0±1.0)個和(33.0±2.0)個；模型組統(tǒng)計結(jié)果分別為(19.0±2.0)個和(21.0±1.0)個,干預(yù)組家兔該項指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果明顯高于其他兩組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2凋亡心肌細(xì)胞統(tǒng)計數(shù)量：三組家兔凋亡心肌細(xì)胞的統(tǒng)計數(shù)量,空白組、干預(yù)組、模型組,三組結(jié)果分別為(178.6±36.7)個,(123.5±4.3)個,(291.6±16.7)個。根據(jù)表中數(shù)據(jù)顯示情況,可以發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量明顯低于模型組,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 Nrf2-ARE信號通路指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果個，n=10)

2.3病理學(xué)結(jié)果：模型組和干預(yù)組的家兔心肌組織都接受濃度為5%的多聚甲醛固定,完成包埋、切片以及染色后,在光鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①模型組：家兔的血管壁當(dāng)中可以很清楚地看到聚集了不少的中性粒細(xì)胞,心肌纖維排列相對混亂,著色存在著不均勻情況。還有一些斷裂的心肌纖維,心肌細(xì)胞有大片壞死現(xiàn)象。間質(zhì)也能看到比較明顯的炎性細(xì)胞浸潤情況。②干預(yù)組：能夠看到中性粒細(xì)胞聚集在血管壁當(dāng)中；也出現(xiàn)了心肌纖維排列混亂和著色不均勻情況。與模型組相比,心肌細(xì)胞壞死范圍更??；能看到比較少的炎性細(xì)胞浸潤情況。模型組和干預(yù)組第5天的病理學(xué)觀察結(jié)果,見圖1～2。

圖1 模型組細(xì)胞切片結(jié)果(×100)

圖2 干預(yù)組細(xì)胞切片結(jié)果(×100)

3 討論

雖然當(dāng)前冠心病相關(guān)疾病的治療技術(shù)已經(jīng)得到了很大程度的提升,但是冠心病相關(guān)心臟病導(dǎo)致的死亡率和致殘率仍然很高。尤其是當(dāng)患者心肌缺血再灌注時,會給患者本身帶來嚴(yán)重的二次傷害[2]。心肌細(xì)胞在缺氧、缺血后,會導(dǎo)致機(jī)體生理和病理出現(xiàn)較為復(fù)雜的變化。有更多的鈣離子會進(jìn)入到線粒體當(dāng)中,危及線粒體的正常功能。當(dāng)機(jī)體處于心肌缺血狀態(tài)下,激活炎性反應(yīng),若再灌注,便會讓已經(jīng)出現(xiàn)的心肌炎性反應(yīng)變得更加嚴(yán)重[3]。在病理發(fā)展中,有很多促炎因子被釋放,如IL-6、IL-8以及干擾素等,帶來比之前更嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。這都會成為影響最終治療效果的不利因素[4]。所以,這些年來也有越來越多的學(xué)者開始關(guān)注心肌缺血再灌注的預(yù)防措施和應(yīng)對策略。

3.1Nrf2-ARE對IRI的保護(hù)機(jī)制：在心血管系統(tǒng)當(dāng)中,Nrf2的表達(dá)整體比較穩(wěn)定,也可以起到很好的保護(hù)心肌效果。Nrf2-ARE通路在內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答機(jī)制當(dāng)中,也起到了十分關(guān)鍵的作用。借助于氧化應(yīng)激作用,能夠讓Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄速度不斷加快,加快形成Nrf2蛋白。再對下游的二相解毒酶基因表達(dá)、抗氧化蛋白等起到調(diào)節(jié)作用,減少氧化損傷所帶來的不利影響。雖然當(dāng)前不同學(xué)者對于這一指標(biāo)的表達(dá)觀點存在差異,但是對其作用認(rèn)同度比較高的是：其具有較好的抗氧化應(yīng)激效果。通過Nrf2-ARE通路,不同藥物都可以介導(dǎo)抗IRI,起到保護(hù)效果[5]。本研究結(jié)果顯示,干預(yù)組患者在開展了Nrf2激活聯(lián)合加味丹參飲治療之后,患者的Nrf2-ARE雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)了十分顯著的增加,而且與模型組相比,之間的差異比較顯著。若ROS數(shù)量比較大會對線粒體氧化磷酸化的持續(xù)作用起到抑制,降低了合成能量的數(shù)量。當(dāng)心肌細(xì)胞再灌注處于早期階段時,會降低抗氧化酶的活性以及所釋放的氧自由基,最終會讓心肌細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的受損情況[6]。而Nrf2-ARE信號通路,則可以對氧化反應(yīng)和炎性反應(yīng)都起到相應(yīng)的抑制作用,減少ROS的數(shù)量。

3.2加味丹參飲對IRI的改善機(jī)制：在冠心病的發(fā)展過程中,心肌IRI是其中的一個構(gòu)成環(huán)節(jié)?；谥嗅t(yī)視角來看,并無與心肌IRI相關(guān)的專有名詞。但是結(jié)合此種疾病的具體發(fā)病原因和位置,在中醫(yī)當(dāng)中將其納入到了“真心痛”等范疇、中醫(yī)辨證認(rèn)為此種疾病屬于氣虛血瘀所致,本虛標(biāo)實帶來的疾病。加味丹參飲這一藥物本就是缺血性心臟病治療當(dāng)中的常見藥物。由于疾病的發(fā)病位置在心,所以將原本方劑當(dāng)中的砂仁去除掉,增加了黃芪、紅花、當(dāng)歸和赤芍等。黃芪具有補(bǔ)氣培元的效果。引入丹參能夠起到專入血分功效,到達(dá)患者臟腑,起到化瘀功效。當(dāng)歸則可以起到濡養(yǎng)扶正,治本的功效。整個方劑的功效是通絡(luò)止痛、活血益氣等。同時本研究還構(gòu)建起了IRI模型,結(jié)合中西醫(yī)理論來分析加味丹參飲對于患者心肌IRI起到的改善作用和保護(hù)機(jī)制。

細(xì)胞凋亡和心肌IRI的發(fā)生之間也存在著十分密切的相關(guān)性。這是因為接受再灌注之后,雖然心肌當(dāng)中得到了有效的血供,但是也讓形成的氧自由基數(shù)量增加,使鈣離子的含量超標(biāo),加速心肌細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[7]。這些年有學(xué)者在其研究中指出,導(dǎo)致心肌細(xì)胞基因的表達(dá)和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常的原因主要是能量代謝[8]。細(xì)胞出現(xiàn)壞死或者是凋亡的關(guān)鍵影響因素則是細(xì)胞內(nèi)部的ATP水平。心肌IRI情況時,體內(nèi)的Bcl-2表達(dá)水平是不斷降低的狀態(tài),而Bax的表達(dá)則在不斷增強(qiáng)。

本研究把30只家兔劃分成了三組,空白組、干預(yù)組和模型組。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的免疫雙標(biāo)陽性細(xì)胞高于模型組,凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量少于模型組。心肌細(xì)胞壞死范圍更小,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤的情況也輕于模型組。以上這一結(jié)果都說明了加味丹參飲+Nrf2激活劑干預(yù)的干預(yù)組家兔,心肌纖維的排列整齊程度得到明顯改善。心肌細(xì)胞內(nèi)水腫程度較輕,未看到肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,核膜也基本上保持完整。所以認(rèn)為干預(yù)組的整體干預(yù)效果更好,針對Nrf2激活以及加味丹參飲的應(yīng)用都能夠讓研究對象的IRI心肌功能與結(jié)構(gòu)情況得到改善,更好地保護(hù)研究對象的心肌功能。

綜上所述,針對心肌缺血再灌注損傷采用加味丹參飲進(jìn)行干預(yù),可以幫助更好地保護(hù)研究對象的心肌細(xì)胞,有更優(yōu)的改善效果。