陳 說,張 帆,吳佩嫻,范艷飛,彭衛(wèi)群,洪小瑜

(北京大學深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東 深圳 518036)

近年來,腸道菌群被視為一種內(nèi)分泌器官,其結構和功能的改變在肥胖發(fā)生中占據(jù)重要作用[1],逐漸成為研究熱點。膽汁酸由肝臟合成經(jīng)膽總管分泌入腸道可以促進脂類消化吸收；作為信號分子,調節(jié)機體的糖脂代謝；參與維持腸道正常功能[2]。膽汁酸膳食是否引起體內(nèi)膽汁酸水平的變化及其對機體代謝及腸道菌群的影響尚未明確。本研究通過建立高脂大鼠模型和普通飼料添加膽汁酸喂養(yǎng)的大鼠模型,檢測血液中膽汁酸、白細胞介素(IL)-18、瘦素以及糞便中擬桿菌門和厚壁菌門的比例,通過與正常對照組比較,初步探討膽汁酸膳食可能通過激活炎性反應和改變腸道誘導大鼠的代謝指標及腸道菌群結構的影響,進而為脂肪肝及肥胖的防治提供新的方向。

1 材料與方法

1.1動物與試劑：8周齡的SD雄性大鼠(斯萊克公司),高脂飼料(斯萊克公司),去氧膽酸(Sigma-aldrich公司),生化指標檢測試劑盒(中生北控生物公司),大鼠瘦素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠IL-18 ELISA試劑盒、糞便基因組提取試劑盒(DP328-02) (天根生化科技有限公司),SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(QPK-201) (TOYOBO公司)Premix Taq Version 2.0(TAKARA公司),10*TBE(Promega公司)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立:健康8周齡的SD雄性大鼠30只,動物等級SPF,體重160～180 g。先統(tǒng)一喂養(yǎng)正常飼料7 d,第7天進行體重的稱量并采集每只動物的糞便樣品,為零時刻樣品。此后隨機將實驗動物分成三組,第一組對照組10只大鼠喂食正常飼料；第二組高脂飲食組10只大鼠喂食高脂飼料；第三組膽酸組10只大鼠喂養(yǎng)正常飼料+膽酸(100 mg/kg)；以上三組均1次/d，共8周。

1.2.2樣本收集:實驗期間大鼠自由攝食和飲水,共喂養(yǎng)56 d,每10天收集上述三組共30只大鼠新鮮糞便樣本(采用逼迫法收集)用于檢測腸道菌群結構的變化,一共收集5次；從分組時的零時刻開始每周對三組大鼠進行體重的稱量,每天觀察大鼠的皮毛色澤、飲食變化、活動狀態(tài)及糞便形態(tài),以評價大鼠的表象特征。實驗分組期末,各組禁食12 h,用戊巴比妥將大鼠麻醉,注射器采血后立即離心分離血清、血漿。測定血清空腹血糖(FBG)、丙氨酶氨基轉移酶(ALT)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、總膽汁酸(TBA)。放免法測定空腹胰島素(FINS)。計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：FBS×FINS/22.5。

1.2.3ELISA樣本準備,收集血清100 μl/孔；按試劑盒說明書稀釋標準品；每孔加100 μl標準品或樣本,37℃孵育1 h每孔加100 μl檢測試劑A,37℃孵育1 h緩沖液洗滌3次；每孔加100 μl檢測試劑A,37℃孵育30 min；緩沖液洗滌3次；每孔加入90 μl基質溶液，室溫孵育30 min,50 μl終止溶液終止；450 nm讀取OD值。

1.2.4腸道菌群RT-PCR:糞便基因組提取試劑盒提取各樣品基因組DNA,并檢測DNA濃度,調整各樣品DNA濃度至10 ng/μl；利用實時定量PCR技術檢測各樣品中厚壁菌群,擬桿菌群基因的相對含量。計算如下：對應樣品中目標基因Xn的相對含量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=ΔCTxn-ΔCTA1；其中ΔCTxn為對照組目的基因減去內(nèi)參基因β-actin的循環(huán)數(shù),ΔCTA1為干預組目的基因減去內(nèi)參基因β-actin的循環(huán)數(shù)；通過以上計算方法計算各樣品厚壁菌群、擬桿菌群基因相對含量。

2 結果

2.1高脂飼料和膽汁酸喂養(yǎng)對大鼠血清生化指標的影響：與對照組相比,高脂飲食組及膽酸組血清中FBG、TC、TG、TBA、ALT和FFA均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；膽酸組的升高不如高脂飲食組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。表明高脂飲食組和膽酸組均可誘導大鼠出現(xiàn)糖、脂代謝紊亂、肝功能異常,但膽酸組的影響小于高脂飲食組。

2.2高脂飼料和膽汁酸喂養(yǎng)對大鼠體重及血清IL-18和瘦素的影響：三組大鼠在干預前體重無明顯差異,喂養(yǎng)期間體重均穩(wěn)定增加,干預結束時高脂飲食組及膽酸組大鼠的體重增量較正常組高但無顯著差異,而血清HOMA-IR、 IL-18和瘦素明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中高脂飲食組血清中IL-18和瘦素較膽酸組升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),相關分析顯示,HOMA-IR與血清FFA、IL-18、瘦素水平呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(r分別為0.85,0.72,0.87,均P<0.01),血清瘦素及IL-18之間呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(r=0.89,P<0.01)。見表2。提示膽酸干預與高脂喂養(yǎng)均可以誘導大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗及炎性反應并導致體重增加,而膽酸組的影響小于高脂飲食組。

表1 各組大鼠血清中生化指標

表2 各組大鼠體重增量及血清中IL-18和瘦素水平

2.3高脂飼料和膽汁酸喂養(yǎng)對大鼠腸道菌群基因表達的影響：與對照組相比,高脂飲食組和膽酸組大鼠糞便中的厚壁菌群基因表達均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而且在高脂飲食組更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1；擬桿菌群基因則表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2；擬桿菌群與厚壁菌群比例呈下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。后兩者在高脂飲食組和膽酸組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：與對照組比較,①P<0.01；與高脂飲食組比較,②P<0.01圖1 各組大鼠糞便中厚壁菌群的基因表達量

注：與對照組比較,①P<0.01圖2 各組大鼠糞便中擬桿菌群的基因表達量

注：與對照組比較,①P<0.01圖3 各組大鼠糞便中擬桿菌群與厚壁菌群表達的比例

3 討論

不同的膳食結構對糖脂代謝存在明顯影響,本研究中高脂模型組大鼠TG、TC、TBA、ALT水平高于正常對照組,體重有增加趨勢但差異不明顯考慮可能與喂養(yǎng)周期較短及喂養(yǎng)末期大鼠產(chǎn)生厭食相關。這與既往在高脂喂養(yǎng)大鼠模型中觀察到的結果類似[3]。高脂飲食對糖脂代謝產(chǎn)生影響機制主要在于肝內(nèi)膽汁酸淤積、干擾肝臟處理血脂能力,導致多余的脂肪在肝臟及體內(nèi)臟器累積,血漿中脂肪酸升高,最終引起血脂代謝紊亂、肥胖等疾病的發(fā)生[4]。本研究中觀察到8周的去氧膽酸膳食在大鼠體內(nèi)可代謝為脫氧膽酸(屬于疏水性膽汁酸),形成血漿中膽汁酸堆積,FFA增加及血脂代謝紊亂?？赡艿臋C制在于疏水性膽汁酸可溶解細胞膜膜脂,從而引起細胞壞死[5-6],誘導細胞毒性作用及體內(nèi)血清膽固醇的水平增高[7]。膽酸組大鼠轉氨酶異常并伴隨膽固醇升高,也間接證實了膽汁酸喂養(yǎng)可能通過肝細胞毒性作用進而引起血脂異常。

高脂飲食能夠誘導大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗,其機制主要涉及瘦素、細胞炎性因子的分泌增加。高胰島素血癥可增加脂肪細胞瘦素的表達,由此形成高瘦素與胰島素抵抗間的惡性循環(huán)。IL-18是腫瘤壞死因子(TNF)-α的誘導因子,通過其信號轉導通路中激酶如c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB、IKB激酶(IKK)等和細胞因子信號抑制物(SOCS)的激活,阻礙正常的酪氨酸磷酸化而導致IR和肥胖[8]。本研究結果顯示,膽酸喂養(yǎng)大鼠血清中瘦素及IL-18、HOMA-IR升高,其可能機制為膽汁酸攝入后在體內(nèi)代謝為脫氧膽汁酸,可誘導產(chǎn)生一系列慢性炎性反應表現(xiàn)為瘦素及IL-18的升高。正常情況下瘦素增加可抑制胰島素分泌,但本研究中發(fā)現(xiàn)大鼠胰島素水平并未下降,提示可能發(fā)生了瘦素抵抗。李靜芳等[9]也發(fā)現(xiàn)在脂代謝紊亂的早期,機體發(fā)生瘦素抵抗,使得瘦素作用減弱,發(fā)生脂肪肝,血清瘦素濃度的代償增加,可反映出肝內(nèi)膽汁沉積的程度[10]。結合本研究的結果,推斷膽汁酸可誘導大鼠增加瘦素分泌及炎性反應從而引起胰島素抵抗。

有研究在人體和動物中發(fā)現(xiàn),肥胖個體腸道中擬桿菌門細菌的含量下降,而厚壁菌門細菌的比例相對升高[11-12]。高脂飲食引起的肝細胞脂肪堆積和胰島素抵抗可導致膽汁酸淤積和膽汁酸成分改變,從而導致腸道菌群失衡,進一步加重膽汁酸代謝紊亂和肝臟炎性反應[13-14]。Janssen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠喂食?；悄懰?TCA)引起腸道菌群結構改變,加劇肝臟炎性反應和肝纖維化。將膽汁酸加入正常小鼠飲食出現(xiàn)體質指數(shù)升高,且其腸道菌群結構近似肥胖小鼠；而將膽汁酸受體激動劑加入高脂小鼠飲食,膽汁酸合成受到抑制,小鼠體質指數(shù)、腸道菌群結構均趨向正常[16]。本研究中膽酸喂養(yǎng)后大鼠糞便內(nèi)的厚壁菌群數(shù)量上升,擬桿菌群數(shù)量下降,擬桿菌群/厚壁菌群比例下降,證明膽汁酸膳食可以誘導大鼠產(chǎn)生類似高脂模型的腸道菌群改變進而參與了胰島素抵抗的發(fā)生,但膽汁酸調控腸道菌群參與肥胖、糖尿病的具體機制比較復雜,仍需要進一步深入研究。展望未來,干預膽汁酸代謝的膳食結構有望成為改善高脂血癥、糖尿病、肥胖等代謝性疾病的新方向。