孫永欣，馬淑慧，王慶志，任同軍，都興范，李樹(shù)英

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連市海產(chǎn)貝類(lèi)種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023 )

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬[1]，因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高成為目前海水養(yǎng)殖的重要品種之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒等引起的疾病對(duì)紅鰭東方鲀養(yǎng)殖造成極大危害[2]。養(yǎng)殖過(guò)程主要通過(guò)化學(xué)藥物和抗生素來(lái)預(yù)防和治療疾病，但是過(guò)量使用化學(xué)藥品和抗生素會(huì)導(dǎo)致病原微生物耐藥性增加及環(huán)境污染等社會(huì)問(wèn)題[3]。為此，科研工作者不斷研發(fā)綠色環(huán)保的抗生素替代物，以作為飼料添加劑預(yù)防魚(yú)類(lèi)疾病。

柞蠶免疫活性物質(zhì)是利用外源益生菌通過(guò)體外人工注射，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后誘導(dǎo)柞蠶(Antheraeapernyi)蛹體產(chǎn)生的抗菌肽、溶菌酶、凝集素等多種活性多肽和蛋白類(lèi)物質(zhì)[4]。前期研究證實(shí)，含有柞蠶免疫活性物質(zhì)的柞蠶免疫蛹粉作為飼料添加劑能顯著提高仿刺參和凡納濱對(duì)蝦的質(zhì)量增加率和抗病力[5-6]。筆者以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉?duì)象，考察柞蠶免疫蛹粉飼料添加劑對(duì)其生長(zhǎng)、免疫和抗病力的影響，為柞蠶免疫活性物質(zhì)免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

紅鰭東方鲀幼魚(yú)購(gòu)自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，初始體質(zhì)量為(58.52±2.07) g，魚(yú)體體表完整無(wú)傷。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的配制

柞蠶免疫蛹粉的制備參考文獻(xiàn)[4]的方法，具體流程為：取健康的柞蠶蛹，按50 μL/頭注射高效誘導(dǎo)源柞蠶鏈球菌(Streptococcuspernyisp. nov.)1212，置于20～22 ℃、自然光照下培養(yǎng)96 h，將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的柞蠶蛹4 ℃下3000 r/min(離心半徑18.9 mm)離心10 min，去掉蛹皮后，經(jīng)噴霧干燥(控制條件為進(jìn)口溫度220 ℃，出口溫度92～97 ℃)制成柞蠶免疫蛹粉。免疫蛹粉和普通蛹粉營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比見(jiàn)表1。試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料為顆粒飼料，購(gòu)自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，其營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

表1 免疫蛹粉和普通蛹粉營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比(干質(zhì)量) %Tab.1 Comparison of nutrients between immuned pupa powder andcommon pupa powder (dry weight)

表2 基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)成分(干質(zhì)量)Tab.2 Nutritional content of basic diet (dry weight)

將免疫蛹粉分別以0.5%、1.0%、2.0%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中，另設(shè)基礎(chǔ)飼料為空白組，同時(shí)設(shè)飼喂不經(jīng)免疫誘導(dǎo)的普通柞蠶蛹粉作為對(duì)照組(添加量1%)，配制成5種紅鰭東方鲀?cè)囼?yàn)飼料，飼料現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

將225尾紅鰭東方鲀隨機(jī)分成5組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行15尾魚(yú)，于大連天正實(shí)業(yè)有限公司大黑石養(yǎng)殖場(chǎng)中暫養(yǎng)7 d后開(kāi)始正式試驗(yàn)。用5種試驗(yàn)飼料投喂試驗(yàn)魚(yú)，分別記為空白組、對(duì)照組、0.5%免疫蛹粉組、1.0%免疫蛹粉組、2.0%免疫蛹粉組，日投喂3次，投餌量為體質(zhì)量的3%，循環(huán)水養(yǎng)殖，水溫18～22 ℃，pH 7.5～8.0，24 h連續(xù)充氧，每日上午清理殘餌和糞便，每周刷洗養(yǎng)殖水槽，試驗(yàn)周期30 d。

1.2.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，稱(chēng)量各組全部紅鰭東方鲀幼魚(yú)的體質(zhì)量并記錄，計(jì)算其相對(duì)質(zhì)量增加率(wWGR，%)。

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

式中，m0為初始體質(zhì)量(g)，mt為終末體質(zhì)量(g)。

從每平行組隨機(jī)選取6尾作為測(cè)定混合樣本，用1 mL一次性注射器心臟取血，于4 ℃條件下凝結(jié) 6 h后離心[4 ℃，4000 r/min(離心半徑5.9 cm)，10 min]，吸取上清液獲得血清樣品，-80 ℃冷凍備用。取血后魚(yú)體組織用于測(cè)定肌肉成分，委托遼寧通正檢測(cè)有限公司檢測(cè)紅鰭東方鲀魚(yú)體蛋白質(zhì)、脂肪、灰分和氨基酸含量。

1.2.4 血清酶活性測(cè)定

酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，詳細(xì)步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 攻毒試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取10尾魚(yú)進(jìn)行病原菌攻毒試驗(yàn)。病原菌為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)，經(jīng)過(guò)二次培養(yǎng)活化后將菌液密度調(diào)至1.0×108cfu/mL，采用背部肌肉多點(diǎn)注射法，對(duì)紅鰭東方鲀體內(nèi)注射菌液0.1 mL。于水槽中養(yǎng)殖，觀察10 d 內(nèi)魚(yú)的死亡情況，計(jì)算免疫保護(hù)率(Rm，%)。

Rm=(1-Re/Rb)×100%

式中，Re為試驗(yàn)組死亡率(%)，Rb為空白組死亡率(%)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 不同添加組紅鰭東方鲀的質(zhì)量增加率

由表3可見(jiàn)，與空白組相比，隨著飼料中免疫蛹粉含量增加，各免疫蛹粉組質(zhì)量增加率分別提高15.98%、18.89%和26.06%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，且2.0%組顯著高于0.5%、1.0%組(P<0.05)。單獨(dú)考察免疫蛹粉組和普通蛹粉組，結(jié)果表明，1.0%、2.0%免疫蛹粉組質(zhì)量增加率提高達(dá)到顯著水平(P<0.05)，可見(jiàn)柞蠶蛹經(jīng)過(guò)免疫誘導(dǎo)后，對(duì)質(zhì)量增加的效果更好。

表3 不同添加量免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀質(zhì)量增加率的影響(n=45)Tab.3 Effects of dietary immuned pupa powder (IPP) on the weight gain rate of tiger puffer T. rubripes

考察對(duì)照組與空白組發(fā)現(xiàn)，飼料中添加普通蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀質(zhì)量增加率有一定提高作用，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同添加組紅鰭東方鲀的肉質(zhì)成分

飼料中添加免疫蛹粉和普通蛹粉對(duì)魚(yú)體肌肉肉質(zhì)成分的影響見(jiàn)表4，飼料中添加普通蛹粉和免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀?nèi)赓|(zhì)粗蛋白、粗脂肪、二十二碳六烯酸、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分均有提高作用，且各免疫蛹粉組均高于普通蛹粉組?？疾觳煌庖哂挤劢M可知，隨著免疫蛹粉添加量的增大，紅鰭東方鲀肌肉中營(yíng)養(yǎng)成分含量也升高。

表4 免疫蛹粉添加量對(duì)紅鰭東方鲀?nèi)赓|(zhì)成分的影響(鮮質(zhì)量) g/100 gTab.4 Effects of dietary immuned pupa powder (IPP) on the flesh composition of tiger puffer Takifugu rubripes (fresh weight)

2.3 不同添加組紅鰭東方鲀非特異性免疫指標(biāo)

與空白組和對(duì)照組相比，飼料中添加免疫蛹粉可顯著提高紅鰭東方鲀血清酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性(P<0.05)(圖1～4)，但對(duì)溶菌酶活性影響不大(圖5)。進(jìn)一步考察表明，添加量對(duì)指標(biāo)影響存在很大差異，其中，0.5%免疫蛹粉組紅鰭東方鲀的酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性顯著高于空白組和對(duì)照組，1.0%免疫蛹粉組堿性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性顯著高于空白組和對(duì)照組，2.0%免疫蛹粉組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于空白組和對(duì)照組，可見(jiàn)添加0.5%免疫蛹粉的綜合效果最佳。

圖1 飼喂不同比例柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀血清酸性磷酸酶活性的影響Fig.1 Effects of different doses of IPP on serum acid phosphatase (ACP) activity of tiger puffer T. rubripes標(biāo)有不同字母表示組間有顯著性差異 (P<0.05)，標(biāo)有相同字母表示組間無(wú)顯著性差異 (P>0.05)，下同.The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.

圖2 飼喂不同比例柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀血清堿性磷酸酶活性的影響Fig.2 Effects of different doses of IPP on serum alkine phosphatase (AKP) activity of tiger puffer T. rubripes

圖3 飼喂不同比例柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀血清總超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effects of different doses of IPP on serum total superoxide dismutase (T-SOD) activity of tiger puffer T. rubripes

圖4 飼喂不同比例柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀血清過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effects of different doses of IPP on serum catalase activity of tiger puffer T. rubripes

圖5 飼喂不同比例柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀血清溶菌酶活性的影響Fig.5 Effects of different doses of IPP on serum lysozyme activity of tiger puffer T. rubripes

對(duì)照組中添加1%普通蛹粉，對(duì)紅鰭東方鲀血清免疫指標(biāo)的影響與空白組差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同添加組紅鰭東方鲀抗病力

紅鰭東方鲀受到哈維氏弧菌攻擊后，自第3天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，直至第7天，空白組全部死亡。統(tǒng)計(jì)其他組發(fā)現(xiàn)，飼料添加不同量免疫蛹粉均能降低紅鰭東方鲀攻毒后的死亡率，其中0.5%組累計(jì)死亡率僅50%，為各組最低，其次是1.0%、2.0%組。對(duì)照組也能降低死亡率，但效果最差(表5)。

表5 攻毒后各組紅鰭東方鲀死亡數(shù)、死亡率和免疫保護(hù)率Tab.5 The incidence of death number, mortality and immune protection rate in the different groups of tiger puffer T. rubripeschallenged with V. harveyi

3 討 論

3.1 飼喂柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀體質(zhì)量和肉質(zhì)成分的影響

柞蠶免疫蛹粉是柞蠶蛹體被誘導(dǎo)出的抗菌蛋白、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等生物抗菌素[7]，經(jīng)噴霧干燥后制備而成的粉末，其中也含有其本身特有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。柞蠶蛹中蛋白質(zhì)的含量達(dá)54%，且氨基酸組成接近聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織建議的蛋白質(zhì)氨基酸組成模式，是理想的全價(jià)昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)[8]。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育具有促進(jìn)作用，在水產(chǎn)動(dòng)物中部分替代魚(yú)粉能促進(jìn)魚(yú)的生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)成分[9-11]。本試驗(yàn)中，對(duì)照組比空白組紅鰭東方鲀體質(zhì)量增加率略高，分析原因是添加柞蠶蛹粉提高了飼料蛋白質(zhì)、氨基酸等成分含量，改善了飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，研究表明，柞蠶蛹經(jīng)過(guò)免疫誘導(dǎo)后能顯著提高紅鰭東方鲀體質(zhì)量增加率，這與在仿刺參(Apostichopusjaponicus)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)中的研究結(jié)果相似[5-6]。對(duì)仿刺參和凡納濱對(duì)蝦的研究表明，動(dòng)物攝食柞蠶免疫蛹粉后，腸絨毛結(jié)構(gòu)改善(結(jié)果待發(fā)表)，腸道菌群運(yùn)算分類(lèi)單元增加，乳酸菌、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和芽孢桿菌(Bacillus)等益生菌相對(duì)豐度顯著提高，潛在致病菌相對(duì)豐度明顯降低[12]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)一步揭示，在攝食柞蠶免疫蛹粉的仿刺參腸道細(xì)胞中，差異表達(dá)蛋白中上調(diào)的蛋白大多富集在能量代謝的通路上[13]。因此，柞蠶免疫蛹粉提高動(dòng)物體質(zhì)量增加率可能與其優(yōu)化腸道菌群以及改善腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。

動(dòng)物體營(yíng)養(yǎng)成分組成變化直接決定了肉質(zhì)和風(fēng)味[14]，而魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)成分與飼料密切相關(guān)[15-17]。本試驗(yàn)中，紅鰭東方鲀攝食含免疫蛹粉飼料后，魚(yú)體肉質(zhì)成分得到明顯改善，鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸)[18]含量提高，說(shuō)明免疫蛹粉提供的營(yíng)養(yǎng)成分通過(guò)合成代謝有效轉(zhuǎn)化成肉質(zhì)成分，不僅提高肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還提高了魚(yú)肉的品質(zhì)。普通蛹粉也能提高魚(yú)體肌肉營(yíng)養(yǎng)成分，但各成分含量低于免疫蛹粉添加組，這是因?yàn)槊庖哂挤劢M魚(yú)的體質(zhì)量更高，因此其肌肉營(yíng)養(yǎng)成分就越高，這與在甌江彩鯉(Cypinuscarpiovar.color)和雜交鱘(Acipenserschrencki♀×A.baeri♂)中的研究結(jié)果一致[19-20]。

3.2 飼喂柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀血清非特異性免疫酶活性的影響

魚(yú)類(lèi)非特異性免疫防御是抵抗病原最重要的屏障，其中發(fā)揮重要作用的是非特異性免疫酶[21]。這些免疫酶的功能各不相同，但相互協(xié)調(diào)共同維持機(jī)體的免疫防御和健康。在魚(yú)體內(nèi)，堿性磷酸酶和酸性磷酸酶在磷酸基團(tuán)的代謝中發(fā)揮重要作用，它們也是魚(yú)類(lèi)體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志性酶，其活性的高低反映了溶酶體酶防御和消化功能的強(qiáng)弱[22]。溶菌酶為專(zhuān)門(mén)作用于微生物細(xì)胞水解的酶，是魚(yú)類(lèi)非特異性免疫的重要組成部分[23]。作為主要抗氧化保護(hù)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶，在抗衰老、抗炎癥方面起著非常重要的作用[24]，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶協(xié)同作用可分別清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基和自由基被分解過(guò)后的過(guò)氧化氫產(chǎn)物，其活性的高低可反映動(dòng)物機(jī)體在脅迫環(huán)境下的免疫力[25]。本試驗(yàn)中，飼料中添加免疫蛹粉后，紅鰭東方鲀血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性顯著提高，表明免疫蛹粉能提高紅鰭東方鲀免疫力和抗逆性，保證紅鰭東方鲀免疫系統(tǒng)處于更為健康的狀態(tài)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，免疫蛹粉提高紅鰭東方鲀免疫力具有劑量效應(yīng)，飼料中免疫蛹粉含量過(guò)高其免疫提高效果反而有降低趨勢(shì)，這可能與機(jī)體自我保護(hù)有關(guān)，具體機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

3.3 飼喂柞蠶免疫蛹粉對(duì)紅鰭東方鲀抗病力的影響

考察動(dòng)物攻毒后存活率能直觀評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體免疫抗病能力的高低。本試驗(yàn)中，攝食免疫蛹粉的紅鰭東方鲀攻毒后存活率均比空白組和對(duì)照組提高，且存活率最高的是0.5%免疫蛹粉組，這同免疫酶指標(biāo)結(jié)果一致。各試驗(yàn)組紅鰭東方鲀?cè)诠ザ竞缶谕惶斐霈F(xiàn)死亡，免疫蛹粉組并未出現(xiàn)死亡延后的現(xiàn)象，可能是樣本量少，未體現(xiàn)出延緩死亡的效果，但明顯降低累計(jì)死亡率，死亡率僅為空白組的一半。與之相比，飼料中只添加普通蛹粉對(duì)免疫指標(biāo)和攻毒后存活率影響甚微，也說(shuō)明免疫蛹粉中的活性成分發(fā)揮了重要作用。

柞蠶免疫活性物質(zhì)究竟如何誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫力是最終要闡明的。結(jié)合已有的研究，推測(cè)這種免疫調(diào)節(jié)作用極可能來(lái)自于腸道菌群的活動(dòng)。免疫蛹粉中的活性成分體外被證實(shí)對(duì)多種致病菌具有廣泛的抑菌和殺菌功能，但對(duì)有益菌無(wú)影響[26]。已經(jīng)證實(shí)，進(jìn)入腸道中的這些活性物質(zhì)調(diào)節(jié)并改善了腸道菌群結(jié)構(gòu)[12]，至于腸道菌群如何通過(guò)與宿主腸上皮細(xì)胞的免疫互作發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用將是下一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

通過(guò)飼料中添加柞蠶免疫蛹粉提高紅鰭東方鲀質(zhì)量增加率、免疫力和抗病力，對(duì)實(shí)際養(yǎng)殖增收增產(chǎn)效果明顯，有望開(kāi)發(fā)成為新型生物抗菌素并在紅鰭東方鲀健康養(yǎng)殖中使用。此外，我國(guó)蠶蛹類(lèi)資源巨大，主要是作為食用資源開(kāi)發(fā)利用。開(kāi)發(fā)柞蠶蛹產(chǎn)品用于水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖不僅能擴(kuò)展蠶桑資源應(yīng)用領(lǐng)域，也為解決當(dāng)下消費(fèi)者關(guān)注的抗生素藥物殘留問(wèn)題提供思路。綜合成本和使用效果，建議在飼料中實(shí)際添加量不超過(guò)0.5%。