趙曉雅，馬 叢，孫美玲，于生金

(遼東學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，遼寧 丹東 118001)

肝癌是世界和亞洲發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]。目前，手術(shù)切除是治療肝癌的首選方法，患者的5年生存率低于50%。腫瘤轉(zhuǎn)移是危及惡性腫瘤患者生命的主要原因，而腫瘤細(xì)胞的異常侵襲是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[2]。精準(zhǔn)靶向治療已經(jīng)成為惡性腫瘤治療的發(fā)展趨勢，因此，探討腫瘤侵襲相關(guān)分子的表達(dá)模式，并探尋相關(guān)的干預(yù)靶點(diǎn)將有可能為新型抗肝癌藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)，為臨床抗肝癌治療提供新的方法和策略。

多配體蛋白聚糖-1(Syndecan-1，SDC-1)表達(dá)于細(xì)胞表面，是硫酸肝素蛋白聚糖家族成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞黏附、分化、增殖等生理過程[3]。乙酰肝素酶(Heparanase，HPSE)是一種β-內(nèi)切糖苷酶，能夠降解細(xì)胞表面的SDC-1[4]。研究表明，腫瘤細(xì)胞表面SDC-1的定位發(fā)生異常改變與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，其中HPSE作用于SDC-1是導(dǎo)致SDC-1從腫瘤細(xì)胞表面脫落，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素[5]，但該作用是否調(diào)控人肝癌轉(zhuǎn)移還不明確。本研究旨在探討SDC-1的定位改變對高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97-H侵襲行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞MHCC97-H購自細(xì)胞生物學(xué)研究所(上海)。細(xì)胞生長在含有4.5 g/L葡萄糖和體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(Gibco，美國)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)中，并在37 ℃和5%體積分?jǐn)?shù)的CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 HPSE小干擾RNA的轉(zhuǎn)染

HPSE小干擾RNA(siHPSE)購自Santa Cruz公司(美國)。具體轉(zhuǎn)染操作按照Invitrogen公司(美國)的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行，以無關(guān)序列的小干擾RNA(siNC) 作為陰性對照。

1.3 低分子量肝素處理細(xì)胞

分別使用20、40 IU/mL的低分子量肝素(LMWH)(Pharmion公司，美國)處理MHCC97-H細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，未處理的細(xì)胞作為對照。

1.4 熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測mRNA表達(dá)

使用TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)提取總RNA，按照TaKaRa公司(大連)的cDNA合成試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行Real-time PCR檢測。以β-actin作為對照，采用2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測

不同處理組細(xì)胞在質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛中固定10 min后用質(zhì)量濃度1%的BSA封閉40 min。一抗為1∶100的SDC-1兔抗人單克隆抗體(Abcam公司，美國)，二抗為1∶200的FITC標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記細(xì)胞核后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測

每個(gè)transwell小室加入40 μL基質(zhì)膠。含4×104個(gè)細(xì)胞的150 μL無血清培養(yǎng)基加入上室，500 μL體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室，常規(guī)培養(yǎng)48 h后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛固定15 min，用質(zhì)量濃度為0.1%的結(jié)晶紫染色10 min后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，取侵襲細(xì)胞平均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HPSE特異性小干擾RNA抑制HPSE的mRNA表達(dá)

為了驗(yàn)證SDC-1定位對人肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，利用HPSE特異性小干擾RNA和HPSE活性抑制劑低分子量肝素(LMWH)分別處理人肝癌細(xì)胞MHCC97-H，并用Real-time PCR法分析HPSE的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與陰性對照(H/siNC)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比較，HPSE特異性小干擾RNA的轉(zhuǎn)染(H/siHPSE)明顯降低了細(xì)胞中HPSE的mRNA水平(P<0.05)；與未處理(MHCC97-H)的細(xì)胞相比較，LMWH處理對HPSE的mRNA表達(dá)沒有影響(圖1)。

2.2 下調(diào)HPSE表達(dá)能夠增加細(xì)胞表面SDC-1的定位

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HPSE表達(dá)及活性下調(diào)對SDC-1定位的調(diào)控作用，利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞表面SDC-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與陰性對照轉(zhuǎn)染(H/siNC)細(xì)胞相比，HPSE特異性小干擾RNA的轉(zhuǎn)染(H/siHPSE)明顯增加了細(xì)胞表面SDC-1的熒光染色強(qiáng)度；同樣，與未處理的MHCC97-H細(xì)胞比較，LMWH處理后細(xì)胞表面SDC-1的熒光染色顯著增強(qiáng)(圖2)。

2.3 細(xì)胞表面SDC-1的定位增加能夠抑制細(xì)胞侵襲

為了明確細(xì)胞表面SDC-1定位的增加對細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為的影響，應(yīng)用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)分析了細(xì)胞侵襲能力的變化，結(jié)果顯示：與陰性對照轉(zhuǎn)染(H/siNC)相比，HPSE特異性小干擾RNA的轉(zhuǎn)染(H/siHPSE)明顯減少了細(xì)胞的侵襲數(shù)量；與未處理的MHCC97-H細(xì)胞比較，LMWH處理后細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著下降(圖3)。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)惡性細(xì)胞擴(kuò)散的多階段有序過程，經(jīng)典的從腫瘤起源到遠(yuǎn)處器官的定植轉(zhuǎn)移過程主要由腫瘤在原發(fā)部位增殖失控、局部侵襲、腫瘤細(xì)胞滲入血管、在血管內(nèi)生存、外滲和在遠(yuǎn)隔器官種植等基本步驟構(gòu)成[6]。SDC-1是一種重要的跨膜蛋白聚糖，參與調(diào)節(jié)黏附、分化和增殖等細(xì)胞行為。研究表明，HPSE和SDC-1以協(xié)同作用方式共同介導(dǎo)包括癌癥等在內(nèi)的多種病理過程[7]。HPSE的上調(diào)通過作用于SDC-1促進(jìn)單純皰疹病毒的感染[8]。HPSE誘導(dǎo)的SDC-1脫落激活VEGFR依賴的骨髓瘤侵襲[9]。臨床前和臨床研究表明，以HPSE和SDC-1為靶點(diǎn)的治療有望阻斷癌癥的惡性行為[10]。盡管HPSE和SDC-1分別在肝癌組織中呈現(xiàn)陽性表達(dá)，但它們之間的潛在關(guān)系、臨床意義和對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制還不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清中檢測到高水平的SDC-1能夠判定的患者的預(yù)后較差[11]。有學(xué)者甚至預(yù)測，血清中的脫落型SDC-1有可能作為一種臨床肝癌患者的診斷標(biāo)志物[12]。但是SDC-1本身是一種表達(dá)于細(xì)胞膜表面的蛋白聚糖，為什么在轉(zhuǎn)移性肝癌中會(huì)出現(xiàn)可溶性SDC-1?SDC-1這種定位的改變會(huì)如何影響肝癌的發(fā)生發(fā)展？這些問題需要進(jìn)一步研究。本研究中，利用HPSE特異性小干擾RNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞MHCC97-H后發(fā)現(xiàn)，HPSE的mRNA表達(dá)明顯減少。重要的是，HPSE表達(dá)下調(diào)后SDC-1在細(xì)胞膜的定位顯著增加，而且HPSE的抑制劑低分子量肝素處理細(xì)胞獲得了同樣的效果。因此，在肝癌患者中HPSE可能是導(dǎo)致SDC-1從肝癌細(xì)胞表面脫落進(jìn)入血液的重要因素。

SDC-1參與Wnt信號(hào)體的形成，并活化多發(fā)性骨髓瘤中異常的Wnt/β-catenin信號(hào)和細(xì)胞增殖[13]。在血管內(nèi)皮鈣黏素依賴性內(nèi)皮細(xì)胞侵襲過程中，SDC-1能夠調(diào)控SDC-1、胰島素樣生長因子-1受體和整合素αVβ3復(fù)合體的形成[14]。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，在低轉(zhuǎn)移小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中，SDC-1表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)細(xì)胞侵襲[15]，而且高轉(zhuǎn)移小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F中SDC-1/VEGF-C復(fù)合物解離促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞MHCC97-H表面SDC-1定位的增加，有效抑制了細(xì)胞的侵襲性。

綜上所述，人肝癌細(xì)胞表面表達(dá)的SDC-1能夠阻止細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為，HPSE通過作用于SDC-1可以促進(jìn)人肝癌細(xì)胞侵襲。因此，阻斷HPSE與SDC-1之間的聯(lián)系有可能為臨床肝癌治療提供新的思路。