吳碧君， 劉小英

(莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 莆田 351144)

大杯蕈(Panusgiganteus)又名巨大革耳、豬肚菇、大杯傘、漏斗菇、大杯香菇等，是一種中高溫型食用菌品種[1]。大杯蕈菌肉肥厚、口感脆爽鮮美，子實(shí)體中富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等[2-3]，在市面上深受消費(fèi)者喜愛。目前，市面上大杯蕈菌種管理較為混亂，同種異名、異種同名等現(xiàn)象較為普遍，給大杯蕈良種收集選育、資源管理與菌株鑒定帶來巨大困難。分子生物技術(shù)從DNA水平上分析菌株間的遺傳多樣性，不受食用菌栽培環(huán)境和傳統(tǒng)栽培周期的影響，可以快速高效地分析菌株間的親緣關(guān)系。

其中，簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat,ISSR)技術(shù)具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4]，已被應(yīng)用于食用菌菌株鑒定、遺傳多樣性分析、輔助育種等方面[5-9]。高傲等[10]采用ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對22個雞腿菇菌株的遺傳多樣性進(jìn)行綜合分析，供試雞腿菇菌株在遺傳相似系數(shù)為0.8時可分為4大類，聚類分析與主坐標(biāo)分析基本一致。楊和川等[11]基于分子標(biāo)記技術(shù)研究了10株杏鮑菇的遺傳多樣性，結(jié)果表明，供試菌株在遺傳相似系數(shù)為0.68時可分為3類，且RAPD分析結(jié)果與主成分分析一致。張妍等[12]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合菌絲生長速度等農(nóng)藝性狀研究20個金頂側(cè)耳菌株種內(nèi)遺傳多樣性，研究顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.65時，絕大部分菌株呈現(xiàn)較強(qiáng)的地域性，按照南北方來源地聚為2類；表型性狀與基因型結(jié)果基本吻合，親緣關(guān)系遠(yuǎn)的菌株農(nóng)藝性狀差異大。表型農(nóng)藝性狀是傳統(tǒng)菌種鑒別方法之一，但極易受到環(huán)境的影響，只能鑒別到屬內(nèi)種間水平[13]，結(jié)合ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)，可以提供更準(zhǔn)確的遺傳多樣性結(jié)果。目前，有關(guān)大杯蕈的研究主要集中在栽培技術(shù)、蛋白質(zhì)營養(yǎng)、多糖等活性物質(zhì)的研究[14-16]，針對大杯蕈遺傳多樣性的研究鮮少報道?；诖耍狙芯坎捎肐SSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過計算遺傳相似系數(shù)、聚類圖，結(jié)合大杯蕈子實(shí)體形態(tài)，分析10個大杯蕈菌株的遺傳多樣性，以期為大杯蕈菌株鑒定和良種選育等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

10個供試大杯蕈菌株編號、來源如表1所示。

1.1.2 試劑及引物

本試驗(yàn)所用DNA marker、TaqPCR Mix、4s Gel Red染料、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖B、5×TBE、TE緩沖液及ISSR引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

表1 供試的10個大杯蕈菌株

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，定容至1 000 mL，pH值自然。

原種及栽培袋培養(yǎng)基：63%木屑+20%棉籽殼+16%麩皮+1%石灰，原種培養(yǎng)基含水量為50%～55%，栽培種為60%，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生物學(xué)特征測定方法

在18 mm×180 mm的試管內(nèi)接種供試母種，以活化菌絲體。每個菌株設(shè)3個重復(fù)，將接種完的供試菌株試管置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察菌絲生長情況，記錄菌絲顏色。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

將滅菌玻璃紙鋪入PDA平板，并從活化后的大杯蕈菌株斜面上挑取菌絲塊接種于PDA平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)7～15 d。培養(yǎng)結(jié)束后，刮取平板上活化后的菌絲作為試驗(yàn)材料，采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA(上海生工生物工程股份有限公司)。提取物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和條件

ISSR-PCR反應(yīng)的總體系為50 μL，反應(yīng)體系為：25 μLTaqPCR Mix，4 μL引物(10 μmol·L-1)，2 μL模板DNA，19 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，45～55 ℃(退火溫度依不同引物而定)退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，40個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 電泳和數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。電泳圖譜中在同一水平位置上擴(kuò)增出的強(qiáng)帶或可分辨性好的弱帶，賦值“1”，未擴(kuò)增出條帶，賦值“0”，形成0/1數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大杯蕈菌絲及子實(shí)體形態(tài)特征

對10個大杯蕈菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)，并觀察菌絲及子實(shí)體形態(tài)特征(表2)。10個大杯蕈菌株菌絲顏色均為白色。菌蓋顏色分為淺褐色、褐色；菌柄顏色分為淺褐色、褐色、米白色3種。按菌株的菌蓋和菌柄顏色劃分，除漳州菌株的菌蓋和菌柄顏色不一致(菌蓋為褐色，菌柄為米白色)，其余9個大杯蕈菌株的菌蓋和菌柄皆為淺褐色或褐色。根據(jù)菌柄類型可分為圓錐形和圓柱形，其中僅T27-1801菌株為圓錐形菌柄。

表2 大杯蕈菌絲及子實(shí)體形態(tài)特征

2.2 大杯蕈菌株ISSR-PCR分析擴(kuò)增結(jié)果

從30條引物中篩選出8條(表3)可以擴(kuò)增出多態(tài)性好、清晰度高條帶的引物，8條引物分別為UBC 809、UBC 816、UBC 817、UBC 818、UBC 856、UBC 857、UBC 878、UBC 888。表3所示，不同引物對供試菌株的擴(kuò)增條帶多態(tài)性不一樣。引物UBC 857擴(kuò)增出26條條帶，多態(tài)率為96.15%。引物UBC 818擴(kuò)增的多態(tài)率最高，為100%。8條引物對10個菌株共擴(kuò)增出的DNA片段大小為200～2 000 bp，共擴(kuò)增出111條條帶，其中多樣性條帶91條，占總帶數(shù)的81.98%，說明10個大杯蕈菌株具有豐富的遺傳多樣性。每條引物對供試菌株的擴(kuò)增條帶為9～26條，平均每個引物擴(kuò)增出11條條帶。引物UBC 817和UBC 857對10個大杯蕈菌株的擴(kuò)增圖譜見圖1。

表3 不同ISSR引物對供試大杯蕈菌株的擴(kuò)增結(jié)果

左圖為引物UBC 817，右圖為引物UBC 857；M為D2000 Marker，1～10為菌株編號。圖1 部分引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 供試菌株遺傳相似性分析

基于ISSR-PCR的擴(kuò)增結(jié)果，采用NTSYSpc 2.10軟件計算供試菌株間遺傳相似系數(shù)(表4)。結(jié)果顯示，10個大杯蕈菌株遺傳相似系數(shù)在0.477～0.856，平均遺傳相似系數(shù)為0.730，表明這10個菌株遺傳關(guān)系較近。菌株JZ007與JZ001相似系數(shù)最小，說明T27-1801和壽光這2個菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；菌株JZ003與JZ006相似度最大為0.856，說明T27-207與東北這2個菌株的親緣關(guān)系較近。

表4 10個大杯蕈菌株遺傳相似系數(shù)

2.4 10個大杯蕈菌株的聚類分析

圖2表明，10個大杯蕈菌株在遺傳多樣性上存在一定的差異。在遺傳相似系數(shù)為0.60時，10個大杯蕈菌株聚為2類；在遺傳相似系數(shù)為0.68水平上分為4類。其中，T27-1801、T212菌株聚為一類；T220單獨(dú)為一類；T27-207、T27-202、東北、壽光、古田、高郵為第3類；漳州菌株單獨(dú)形成第4類。T212為大杯蕈品種莆蕈1號自交后代，T27-1801為莆蕈1號與T212菌株的雜交后代，二者親緣關(guān)系較近聚在一起。結(jié)合大杯蕈子實(shí)體形態(tài)，漳州菌株的菌柄和菌蓋顏色不一致，菌柄米白色區(qū)別于其他9個菌株，這與聚類結(jié)果一致，單獨(dú)聚為一類。T27-207、東北菌株在遺傳相似系數(shù)為0.86處聚為同一類群，這有可能是由于市面上大杯蕈在引種過程中出現(xiàn)的同種異名所致。

圖2 10個供試菌株的UPGMA聚類分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選了8條多態(tài)性好、清晰度高的引物對10個大杯蕈菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。8條引物共擴(kuò)增出111條DNA片段，多樣性條帶91條，多態(tài)率為81.98%，說明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性。供試菌株的平均遺傳相似系數(shù)為0.730，遺傳關(guān)系較近。ISSR分子標(biāo)記可有效分析大杯蕈菌株遺傳多樣性。

菌株、品種間遺傳多樣性分析在食用菌良種選育和種質(zhì)資源保藏中具有重要意義。研究表明，食用菌子實(shí)體顏色等農(nóng)藝性狀可能對遺傳多樣性有一定影響[17]。觀察食用菌子實(shí)體顏色、形態(tài)等農(nóng)藝性狀結(jié)合ISSR等分子標(biāo)記方法從DNA分子水平上檢測菌株基因組間的遺傳多樣性已在多種食用菌上有所報道。目前，大杯蕈還沒有系統(tǒng)的遺傳多樣性分析報道。江玉姬等[18]研究9個巨大革耳菌株的親緣關(guān)系，經(jīng)ISSR聚類分析表明9個菌株分為2類，C.m0002菌株單獨(dú)聚為一類。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，C.m0002菌株的子實(shí)體為多脂鱗傘，為同名異種。宮志遠(yuǎn)[19]搜集35個山東主栽平菇菌株，在遺傳相似系數(shù)為0.665時供試菌株的遺傳關(guān)系可按照子實(shí)體顏色分為黑色、灰黑色、白色3個類群。但是，譚艷[20]利用ISSR分子標(biāo)記方法分析29個金針菇菌株種間的遺傳差異，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)未能按照供試菌株的子實(shí)體顏色區(qū)分開。楊和川[11]基于RAPD技術(shù)研究10個杏鮑菇菌株的遺傳多樣性，在遺傳相似系數(shù)為0.68時將供試菌株分為3類，也未能利用RAPD技術(shù)將供試菌株按照子實(shí)體菌蓋顏色進(jìn)行分類。譚艷等[20]研究結(jié)果與本研究一致，未能利用分子標(biāo)記技術(shù)按照子實(shí)體的顏色區(qū)分供試菌株。真菌的生長速度、子實(shí)體形態(tài)等農(nóng)藝性狀受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受到溫度、濕度等栽培環(huán)境的影響[21]，采用多種分子標(biāo)記綜合分析的結(jié)果能夠更準(zhǔn)確地體現(xiàn)供試菌株間的親緣關(guān)系。汪昊等[22]認(rèn)為，綜合不同的分子標(biāo)記方法進(jìn)行聚類分析，由于原理不同聚類結(jié)果略有差異，但可以更加準(zhǔn)確地反映菌株間的親緣關(guān)系，研究中綜合采用了ISSR、SRAP、TRAP 3種分子標(biāo)記結(jié)果，在遺傳相似系數(shù)為0.75時將19個香菇菌株分為6類。武海月等[13]通過ISSR和SRAP技術(shù)綜合分析19個榆黃菇品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.70時，可將榆黃菇分為4類。高傲等[10]基于ISSR和SRAP的聚類分析結(jié)果將22個供試菌株分為4類，結(jié)果與主坐標(biāo)分析吻合。

因此，在今后的研究工作中應(yīng)從地域、親緣關(guān)系等方面考慮選取材料，擴(kuò)大研究群體，增加引物數(shù)量，結(jié)合農(nóng)藝性狀觀察和拮抗試驗(yàn)；另一方面，豐富分子標(biāo)記方法，融合不同分子標(biāo)記技術(shù)優(yōu)勢。雙管齊下，優(yōu)化聚類結(jié)果，提高遺傳分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。