王 鵬 李海娟 羅偉光 徐源佑 薛甜霞 董 瑞 蔣天琪 邊海霞

（寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏銀川 750021）

雞球蟲病是由多種艾美耳球蟲寄生于雞的腸上皮細(xì)胞引起的原蟲病。該病呈全球性分布，是集約化養(yǎng)雞生產(chǎn)中最常見且危害最嚴(yán)重的寄生蟲病[1]。目前，控制雞球蟲病的方法主要是使用抗球蟲藥物和球蟲病活疫苗，但抗球蟲藥物存在很多問題[2]。因此，球蟲疫苗的使用是球蟲防控的一種理想措施。市面上已有多種球蟲疫苗可供使用，但球蟲卵囊排出外界只有在適宜的條件下才能正常進(jìn)行孢子化，溫度和濕度對球蟲免疫效果具有重要的影響[3]。本公司地處西北地區(qū)，外界氣候相對干燥且雞舍均采用高床平養(yǎng)。雖然目前市場上有多種球蟲疫苗可供使用，但按照常規(guī)使用方法和劑量免疫后效果參差不齊，仍達(dá)不到理想狀態(tài)，雞群球蟲感染及腸炎的問題仍時有發(fā)生，對雞只的生長、生產(chǎn)性能和雞群健康造成嚴(yán)重影響。本試驗(yàn)對市場上5種球蟲疫苗進(jìn)行免疫后效果評估，從而為篩選最適合本公司的球蟲疫苗及為雞群建立良好的球蟲免疫保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物及廠區(qū)。本試驗(yàn)在寧夏某雞場進(jìn)行，試驗(yàn)動物均為2日齡海蘭褐蛋雞，其中一棟舍為球蟲疫苗免疫組，另一棟舍為未免疫對照組，2棟舍均采用高床平養(yǎng)模式，且舍內(nèi)均配有水線、料線、自動噴霧加濕和控溫器等相關(guān)設(shè)備，雞舍的整體條件良好。

1.1.2 試驗(yàn)疫苗。分別選取4個不同廠家5種球蟲疫苗作為試驗(yàn)疫苗，分別標(biāo)記為 A、B、C、D、E 組，其中A、B為同一個廠家的2種不同效價的球蟲疫苗，A為4價，B為4+2價（即B為A在原有的4種蟲卵基礎(chǔ)上再增加2種蟲卵）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 球蟲卵囊計(jì)數(shù)。采用血球計(jì)數(shù)法和麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法同步進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時實(shí)驗(yàn)室與免疫現(xiàn)場以及第三方檢測同步進(jìn)行。

1.2.2 糞便中球蟲卵囊檢測計(jì)數(shù)方法。球蟲首免的卵囊于免疫后第6、7、8天，選擇其中2 d進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)即可；自然二免組結(jié)果于免疫后第13、14、15天，選擇其中2 d進(jìn)行檢測；人工輔助二免組應(yīng)于飼喂人工孵育糞便后的第6、7、8天，選擇其中2 d進(jìn)行檢測。

按照盲腸糞∶小腸糞為1∶4的比例收集糞便，收集5堆盲腸糞和20堆小腸糞。將采集到的新鮮糞便裝入100 mL燒杯中，充分混合均勻。稱量3 g混合均勻的糞便放入燒杯，抽取42 mL飽和鹽水，先加入部分飽和鹽水，用勺子將糞便攪碎混勻后分別加入剩余的鹽水沖洗杯壁。用膠頭滴管吹打均勻混懸液后，吸取混懸液加入麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板中，靜置5～10 min后分別計(jì)數(shù)2個計(jì)數(shù)室內(nèi)的卵囊數(shù)，取平均值，即每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG）。

1.3 免疫操作方法

1.3.1 球蟲疫苗首次免疫操作方法。根據(jù)雞群存欄量按1羽份使用量準(zhǔn)備所需球蟲疫苗。免疫前需控料3～4 h，其間保證正常供水，按照1 000羽份添加20 kg飼料、2 kg水、20 g 4%食品紅溶液進(jìn)行疫苗稀釋，根據(jù)紅色素均一附著飼料情況判斷是否拌勻，將飼料全部混勻?yàn)橹?，最后將拌料總量（飼料、水的總和）按雞數(shù)分配至各間，均勻加入每個料盤中，確保雞群同步開食。球蟲免疫期間確保前21 d濕度不低于40%、溫度不低于30℃。

1.3.2 自然啄食糞便二免。在首次免疫后第6～9天結(jié)束，其間將每日1/3飼料飼喂量撒在牛皮紙上誘導(dǎo)小雞啄食墊紙上糞便，從而完成自然啄食糞便中的球蟲，進(jìn)行二次免疫。

1.3.3 人工輔助二免。第一步：根據(jù)雞只數(shù)量，按照每1 000羽份收集400 g新鮮糞便確定所需雞糞量。第二步：在雞群球蟲疫苗免疫后第6天下午清除架下陳舊糞便，在免疫后第7天收集架下新鮮糞便。第三步：對糞便進(jìn)行孢子化孵育處理，按1 000羽份收集400g雞糞，噴灑1mL安滅殺、200mL水以及600g輔料進(jìn)行配制。第四步：雞群控料2 h以上，將孵育好的糞便混合物與飼料（按照1 000羽加入5～10 kg飼料的比例）拌勻后，按雞數(shù)分配至各間，均勻加入每個料盤中，確保雞群同步開食。

1.4 不同介質(zhì)對球蟲孢子化孵育的方法設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)谷糠、木糠、沙子3個處理，參照1.3.3進(jìn)行配制，將混合物平鋪在塑料膜上，厚度以1 cm左右為宜，每隔4 h加濕1次糞便混合物，噴水后翻攪均勻，將水充分混合進(jìn)孵育介質(zhì)中。孵育至少48 h后，根據(jù)鏡檢結(jié)果確定孵育率較好的孵育介質(zhì)用于人工輔助二免。

1.5 分組及免疫

將球蟲免疫試驗(yàn)雞群隨機(jī)分為6組，其中A～E組為5種不同疫苗免疫組，F(xiàn)組為無球蟲免疫空白對照組，具體分組見表1。

表1 雞球蟲免疫分組及免疫情況

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)室球蟲疫苗計(jì)數(shù)結(jié)果

球蟲免疫試驗(yàn)前，采用血球計(jì)數(shù)與麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法對試驗(yàn)使用的5種疫苗進(jìn)行球蟲卵囊數(shù)量的自檢與第三方盲樣檢測。從表2可以看出，第三方檢測與自檢所測球蟲疫苗中卵囊數(shù)量與疫苗出廠值基本相符，檢測合格。

表2 5組不同球蟲疫苗中卵囊數(shù)檢測結(jié)果

2.2 疫苗首免后糞便中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果對比

收集首次免疫后第6、7、8天糞便，進(jìn)行糞便中球蟲卵囊數(shù)的計(jì)數(shù)以及球蟲疫苗免疫后效果評估。結(jié)果顯示，參考卵囊數(shù)首免后在2萬～10萬個/g標(biāo)準(zhǔn)的前提下，5種不同球蟲疫苗的首次免疫均成功（表3）。在單一考慮球蟲卵囊數(shù)的情況下，疫苗效果表現(xiàn)為 C＞A＞D＞B＞E。

表3 首免后糞便中球蟲卵囊數(shù)量檢測結(jié)果 單位：（個·g-1）

2.3 自然二免與人工二免效果對比以及不同孵育介質(zhì)效果對比

在B、C、D、E組球蟲疫苗首免成功的前提下，B組和E組進(jìn)行球蟲自然二免與人工拌糞二免對比，C組（Ⅱ和Ⅲ）與D組（Ⅱ和Ⅲ）進(jìn)行疫苗拌料二免。

二免后糞便中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：在現(xiàn)有養(yǎng)殖模式（高床平養(yǎng)）、環(huán)境（西北地區(qū)外界環(huán)境濕度低）條件下，B組球蟲自然二免與人工拌糞二免、C組與D組疫苗拌料二免免疫后檢測OPG，卵囊數(shù)較低，在0～10 000個/g之間，即B、C、D組的第二次球蟲免疫均失敗，E組自然二免失敗但人工二免OPG較高，E組人工拌糞二免成功?？傮w來講，在現(xiàn)有條件下人工拌糞輔助二免效果優(yōu)于自然二免，即人工輔助二次免疫對雞球蟲病具有良好的免疫效果[4]（表4）。

表4 4種球蟲疫苗首免、自然二免及人工拌糞二免卵囊數(shù)對比 單位：（個·g-1）

2.4 人工輔助二免不同孵育介質(zhì)對糞便中球蟲卵囊孢子化率的對比結(jié)果

谷糠、木糠、沙子3種不同孵育介質(zhì)孵育效果以及拌糞免疫后對雞只腸道損傷評估試驗(yàn)結(jié)果顯示：木糠組球蟲孢子化孵育率最高，為75%，其次為谷糠組（70%）和沙子組（50%）（圖 1）。 3種孵育介質(zhì)對腸道損傷情況評估對比顯示：沙子組優(yōu)于谷糠組，優(yōu)于木糠組。木糠和沙子作為孵育介質(zhì)對雞群的健康可能存在不可控生物安全因素，且孵育過程中臭味較重影響雞群采食量。綜上所述，人工二免孵育介質(zhì)應(yīng)首選粒度適中的谷糠。

3 結(jié)論與討論

球蟲的防控主要依靠藥物和疫苗免疫2種方式。雞群長期使用球蟲藥易產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，因而更適合使用活疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。活疫苗通過球蟲蟲株在雞的腸道黏膜上進(jìn)行4～6 d的內(nèi)生性發(fā)育，刺激機(jī)體形成基礎(chǔ)抗球蟲的免疫力，并隨糞便排出后代卵囊，這些卵囊在墊料中經(jīng)適宜的溫度和濕度進(jìn)行孢子化后，部分卵囊被雞啄食，起到加強(qiáng)免疫的作用，如此重復(fù)感染2～3次后，機(jī)體才能形成持久的免疫力[5]。因此，反復(fù)接種球蟲卵囊對于增強(qiáng)雞只對球蟲的免疫力是一個較好的方法[6]。在本公司現(xiàn)有高床平養(yǎng)飼養(yǎng)模式下，2日齡雛雞免疫試驗(yàn)中的5種球蟲疫苗均可達(dá)到球蟲首免的效果；在首免成功的前提下，通過雞只自然啄食糞便二免和人工輔助二次免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自然二免免疫失敗，而人工輔助二免效果優(yōu)于自然二免，即人工輔助二免對雞球蟲病具有良好的免疫效果；在球蟲卵囊孢子化孵育試驗(yàn)中，谷糠、木糠、沙子3種不同孵育介質(zhì)孢子化孵育效果以及對腸道損傷的綜合對比結(jié)果表明，人工二免孵育介質(zhì)應(yīng)首選粒度適中的谷糠。

綜上所述，本試驗(yàn)中所使用5種球蟲活疫苗中，E組為臨床試驗(yàn)下最適用于本公司高床平養(yǎng)模式下球蟲免疫的疫苗，人工孢子化孵育后拌糞二免效果優(yōu)于自然啄食糞便二免，且在人工輔助二免中選用粒度適中的谷糠作為介質(zhì)可使球蟲的二次免疫效果達(dá)到最佳。