毛紅華 張可爾 張 輝 孫建群 劉炎華 胡 娜 張志敏

湖南省邵陽市中心醫(yī)院腫瘤科 422000

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)屬于一種具有高度侵襲性的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤中較為常見的一種類型，此種腫瘤在臨床特征表現(xiàn)、流行病學(xué)以及預(yù)后等方面具有高度異質(zhì)性，發(fā)病率較高[1-2]。臨床上對于DLBCL的治療多采用CHOP標(biāo)準(zhǔn)化療方案進(jìn)行治療，此種化療方案治療效果較為理想，可延長患者生存周期，但仍有部分患者經(jīng)此方案化療失敗或者再次復(fù)發(fā)，2次治療效果并不理想[3]。目前多采用國際預(yù)后指數(shù)(IPI評分)對DLBCL患者臨床療效和預(yù)后情況進(jìn)行評價(jià)，雖然可在一定程度上評估患者臨床療效和預(yù)后情況，但并不能做到對所有患者準(zhǔn)確評估[4]。因此尋找準(zhǔn)確評估患者臨床療效的敏感指標(biāo)，對患者疾病嚴(yán)重程度、臨床治療、預(yù)后評估具有重要的意義，在本文中分析DLBCL患者血清VEGF和IL-17水平變化，為臨床上此病的診治提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年7月—2020年8月初治彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者60例作為DLBCL組，其中男35例，女25例，年齡35～75歲，平均年齡(55.0±16.0)歲，采用Ann Arbor/Cotswords分期系統(tǒng)對患者進(jìn)行分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期19例，Ⅲ期18例，Ⅳ期11例；參照國際預(yù)后指數(shù)(IPI評分)對患者進(jìn)行預(yù)后危險(xiǎn)分層：低危(0～1分)12例，低中危(2分)20例，高中危(3分)19例，高危(4～5分)9例。另外同期選取于我院健康體檢中心體檢的健康志愿者20例作為健康對照組，其中男11例，女9例，年齡38～74歲，平均年齡(56.0±14.4)歲。兩組性別比例、平均年齡等基線資料對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有研究對象及家屬均知情，且簽署了知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①DLBCL組患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，并完善實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)等檢查，就診前均未接受任何化療等治療；②健康對照組身體健康，無疾病。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除合并自身免疫性疾病者；②排除合并哮喘、COPD、肺炎及其他心肺病變者；③排除合并其他部位惡性腫瘤者；④排除凝血功能異常者；⑤排除預(yù)計(jì)生存期<3個(gè)月者；⑥排除肝、腎等重要障礙不全者；⑦排除精神障礙、交流障礙者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：抽取DLBCL組治療前、健康對照組清晨空腹靜脈血3ml，以離心半徑5cm、轉(zhuǎn)速3 000r/min離心處理10min，分離上層血清，-80℃保存待檢。

1.3.2 血清VEGF水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測血清VEGF水平。將血清樣本置于室溫后，取出試劑盒，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測血清及標(biāo)準(zhǔn)品100μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100μl/孔以終止反應(yīng)，在450nm波長(參考波長570～630nm)測定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與VEGF水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算VEGF水平。

1.3.3 血清IL-17水平檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血清IL-17水平。(1)標(biāo)準(zhǔn)品制備：①將凍干細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)球加入至15ml離心管中，標(biāo)為最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(5000 pg/ml)。②在標(biāo)準(zhǔn)品中加入2ml稀釋液做稀釋處理，在室溫下平衡處理15min，之后將標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻。③取9支12×75mm的流式管標(biāo)記稀釋倍數(shù)，分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，在每管中加入300μl Assay Diluent稀釋液。④梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：從最高濃度比例管開始逐個(gè)加入300μl倍比稀釋液，從最高濃度比例管開始逐個(gè)取300μl溶液至下一管，吹打均勻，直至最后一管，最后在流式管中加入300μl稀釋液作為陰性對照管(0pg/ml)。(2)混合細(xì)胞因子捕捉微球：①微球混合：試驗(yàn)樣本數(shù)包含8個(gè)檢測樣本、1個(gè)陰性對照以及9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，在混合前每種捕捉微球充分渦旋15s，按照10μl/樣本吸收適量的捕捉微球，將所有微球加入至1支流式管中，充分渦旋，混合均勻。②微球重懸：在溫度為37℃下降混合完畢的微球離心處理5min，取上清液，加入與混合完畢的微球質(zhì)量相同的血清增強(qiáng)液，混合均勻，在避光、室溫下孵育30min。(3)樣本孵育：將重懸后的微球充分渦旋，取50μl加入各實(shí)驗(yàn)管中，將50μl梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品加入至各標(biāo)準(zhǔn)品管中，將50μl待測血清加入至各樣本管中，各實(shí)驗(yàn)管中加入50μl PE標(biāo)記的IL-17檢測抗體，在避光、室溫下孵育3h。(4)上機(jī)檢測：將1ml洗液加入至各流式管中以做樣本清洗處理，在200g下離心5min，吸去上清液，在各實(shí)驗(yàn)管中加300ml洗液，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。(5)數(shù)據(jù)分析：上述操作完成后采用FCAP Array v1.0軟件分析IL-17水平。

1.3.4 治療方法：所有初治DLBCL患者均依據(jù)2019中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)指南彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤指南更新要點(diǎn)中RCHOP治療方案進(jìn)行治療，治療后(2個(gè)療程)抽取患者清晨空腹靜脈血，分離血清，檢測血清VEGF和IL-17水平，檢測方法同1.3.2、1.3.3。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組與DLBCL組血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較 如表1所示，DLBCL組血清VEGF表達(dá)水平高于健康對照組，血清IL-17水平低于健康對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 健康對照組與DLBCL組血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較

2.2 不同分期DLBCL患者血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較 如表2所示，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期DLBCL患者血清VEGF水平高于Ⅰ期，血清IL-17水平低于Ⅰ期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅲ期、Ⅳ期DLBCL患者血清VEGF水平高于Ⅱ期，血清IL-17水平低于Ⅱ期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅳ期DLBCL患者血清VEGF水平高于Ⅲ期，血清IL-17水平低于Ⅲ期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同分期DLBCL患者血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較

2.3 不同預(yù)后危險(xiǎn)分層DLBCL患者血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較 如表3所示，低中危、高中危、高危DLBCL患者血清VEGF水平高于低危，血清IL-17水平低于低危，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高中危、高危DLBCL患者血清VEGF水平高于低中危，血清IL-17水平低于低中危，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高危DLBCL患者血清VEGF水平高于高中危，血清IL-17水平低于高中危，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同預(yù)后危險(xiǎn)分層DLBCL患者血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較

2.4 DLBCL患者治療前后血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較 如表4所示，DLBCL患者治療后血清VEGF水平低于治療前，血清IL-17水平高于治療前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 DLBCL患者治療前后血清VEGF和IL-17表達(dá)水平比較

2.5 VEGF、IL-17之間相關(guān)性分析 如圖1所示，VEGF、IL-17之間相關(guān)性采用相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析，VEGF、IL-17之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.343，P=0.007)。

圖1 VEGF、IL-17之間相關(guān)性分析

3 討論

惡性淋巴瘤屬來源于淋巴結(jié)、淋巴結(jié)外部位淋巴組織的一組免疫細(xì)胞腫瘤，經(jīng)彩色多普勒超聲檢查可見腫瘤組織存在較為豐富的血流信號(hào)，具有較為廣泛的浸潤組織器官的疾病特點(diǎn)，DLBCL為非霍奇金淋巴瘤中的常見類型，我國此種腫瘤的發(fā)病率較高，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全[5-6]。DLBCL的發(fā)生與多因素共同作用相關(guān)，目前對于DLBCL的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但多數(shù)研究認(rèn)為此種腫瘤與多數(shù)細(xì)胞因子異常表達(dá)相關(guān)，因此在本文研究中對VEGF、IL-17在DLBCL患者中的水平變化進(jìn)行分析，以期望尋找特異性診治DLBCL的敏感指標(biāo)。

惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與血管生成相關(guān)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)屬于一種作用較強(qiáng)的促血管生成因子，可調(diào)節(jié)腫瘤微血管形成，在淋巴管、血管生成中具有較為重要的調(diào)控作用[7]。VEGF可與其自身受體特異性結(jié)合，一方面可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性、促進(jìn)血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，另一方面可對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響宿主對腫瘤的反應(yīng)[8-10]。目前研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，VEGF可經(jīng)多途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展、發(fā)揮其生物學(xué)特性。(1)VEGF可經(jīng)增強(qiáng)血管通透性，致使纖維蛋白原等血液內(nèi)成分外漏，改變細(xì)胞外基質(zhì)正常特性，進(jìn)而促進(jìn)血管生長；(2)VEGF可經(jīng)釋放前列腺素等物質(zhì)將內(nèi)皮細(xì)胞激活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移；(3)VEGF經(jīng)誘導(dǎo)多種酶、蛋白生成，作用并改變腫瘤局部微環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞uPA受體表達(dá)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移；(4)VEGF將靜止的內(nèi)皮細(xì)胞激活后，促進(jìn)其有絲分裂，參與血管生成；(5)VEGF經(jīng)調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的關(guān)系，促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)淋巴管生長，最終促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；(6)VEGF經(jīng)促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。目前臨床已有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與DLBCL發(fā)生發(fā)展相關(guān)，VEGF及其受體在此病中高表達(dá)，經(jīng)其受體介導(dǎo)信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)腫瘤新生血管形成、腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Broséus等[14]在其研究中認(rèn)為，VEGF在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)，且與腫瘤中保存的免疫應(yīng)答基因特征相關(guān)，可作為此類患者生存的預(yù)測因子。本文研究顯示，與健康人相比，DLBCL患者血清VEGF水平顯著升高，且隨著疾病加重、預(yù)后危險(xiǎn)程度加重，其高表達(dá)更為加劇，患者治療后水平顯著降低，此結(jié)果提示著，VEGF與DLBCL患者疾病加重、預(yù)后危險(xiǎn)程度以及臨床治療相關(guān)。

淋巴瘤的發(fā)生進(jìn)展與細(xì)胞周期失控、染色體易位、調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的信號(hào)因子相關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)[15]，機(jī)體抵抗腫瘤免疫重要以細(xì)胞免疫為主，其中T淋巴細(xì)胞屬于較為重要的免疫細(xì)胞，其中CD4+T細(xì)胞與DLBCL相關(guān)。Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞中的一種，具有較為獨(dú)特的分化發(fā)育特性，當(dāng)IL-6與TGF-β同時(shí)存在時(shí)，經(jīng)調(diào)控STAT-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-17A。IL-17屬于IL-17A家族成員之一，經(jīng)與其家族受體特異性結(jié)合后可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其自身生物學(xué)特性，參與機(jī)體病理變化過程。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在不同類型腫瘤、不同機(jī)體免疫狀態(tài)下具有雙向作用，一方面IL-17可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲，促進(jìn)腫瘤血管生成，抑制抗腫瘤反應(yīng)來發(fā)揮其致癌特性，另一方面，IL-17可募集T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，經(jīng)作用并活化多種信號(hào)通路激活并產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲、腫瘤血管生成，進(jìn)而發(fā)揮其抑癌特性。目前已有多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，IL-17參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病及肺癌、胃癌、DLBCL等腫瘤。本研究結(jié)果顯示，與健康人相比，IL-17患者血清VEGF水平顯著降低，且隨著疾病加重、預(yù)后危險(xiǎn)程度加重，其高表達(dá)更為加劇，患者治療后水平顯著升高，此結(jié)果提示著，IL-17與DLBCL患者疾病加重、預(yù)后危險(xiǎn)程度以及臨床治療相關(guān)。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)，在部分腫瘤中IL-17通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在本文中分析VEGF、IL-17在DLBCL中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示，兩者表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，此結(jié)果提示兩者可能負(fù)性調(diào)節(jié)，促進(jìn)DLBCL發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，DLBCL患者血清VEGF升高，IL-17水平降低，且與患者疾病嚴(yán)重程度、臨床治療、預(yù)后相關(guān)，可作為診治DLBCL的敏感指標(biāo)，為臨床上判斷DLBCL患者預(yù)后及新型免疫治療奠定基礎(chǔ)。