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        響應(yīng)面法優(yōu)化大豆分離蛋白提取及復(fù)合酶解制備活性肽

        2022-03-18 02:22:52孫會(huì)剛陳志軒周中馳李凡松王繼良張傳麗陳學(xué)紅李同祥
        中國(guó)調(diào)味品 2022年3期
        關(guān)鍵詞:大豆抗氧化蛋白質(zhì)

        孫會(huì)剛,陳志軒,周中馳,李凡松,王繼良,張傳麗,陳學(xué)紅,李同祥*

        (1.徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,江蘇 徐州 221018;2.廊坊農(nóng)林科學(xué)院,河北 廊坊 065000)

        大豆蛋白活性肽不但可以為人體提供大豆所能提供的營(yíng)養(yǎng)成分,而且由于其自身特有的各種功能特性被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)與醫(yī)療領(lǐng)域[1]。目前而言,美國(guó)和日本在大豆蛋白活性肽研究方面遙遙領(lǐng)先世界其他國(guó)家,他們使用大豆蛋白活性肽作為原料用于生產(chǎn)幼兒食品、面包、飲料、運(yùn)動(dòng)員專(zhuān)用食品等多種食品。大豆活性肽在國(guó)外也常常作為功能保健食品的主要配料使用[2]。盡管我國(guó)大豆資源豐富,但是,我國(guó)的技術(shù)工藝不夠成熟,所以目前對(duì)大豆蛋白活性肽的研究探索始終處于初級(jí)開(kāi)發(fā)應(yīng)用階段。雖然也取得了一些成效,大豆蛋白活性肽也可以進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn),但是市場(chǎng)上的大豆蛋白活性肽產(chǎn)品還較少,根本不能滿(mǎn)足不斷增加的市場(chǎng)需求量,更無(wú)法與美、日兩國(guó)媲美[3]。

        利用大豆分離蛋白制備活性肽,首先要獲得較高大豆蛋白的提取率,目前報(bào)道的大豆分離蛋白提取方法主要有酶解酸沉法[4]、膜分離法[5-7]及堿提酸沉法[8-9]等。但在大豆深加工領(lǐng)域,由于成本低、技術(shù)水平要求低等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用最多的仍然是堿提酸沉法。對(duì)于大豆分離蛋白提取方法的優(yōu)化已有相關(guān)報(bào)道,但多數(shù)采用單因素或者正交的方法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,而且涉及的影響因素也不夠全面,本文采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對(duì)大豆分離蛋白提取的影響因素進(jìn)行較全面的研究,有望更好地提高提取率。

        為了獲得高抗菌活性的大豆肽,本研究對(duì)大豆分離蛋白的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,采用復(fù)合酶酶解法獲得了高抗菌活性的大豆肽,為開(kāi)發(fā)新型具有防腐保鮮及保健功能的食品添加劑提供了新的思路和資源。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        黃豆:來(lái)自廊坊農(nóng)科院。

        胰蛋白酶(豬胰):購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;糜蛋白酶:購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司;其余試劑:均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 培養(yǎng)基

        LB培養(yǎng)基:根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]制作。

        1.2.2 大豆分離蛋白的提取

        取適量黃豆去雜、烘干、粉碎、過(guò)篩,加入無(wú)菌水,液料比為10∶1,用NaOH調(diào)節(jié)pH值為堿性,水浴加熱并攪拌,7000 r/min離心15 min去渣,重復(fù)3次,取上清;HCl調(diào)pH值為酸性,水浴加熱并攪拌,7000 r/min離心15 min去渣,重復(fù)3次,取上清,加水溶解沉淀,用透析袋透析大豆分離蛋白水溶液過(guò)夜,真空冷凍干燥獲得粗蛋白。

        蛋白質(zhì)提取率=提取的粗蛋白重量/原料大豆重量。

        1.2.3 大豆分離蛋白提取的單因素優(yōu)化

        根據(jù)報(bào)道,大豆分離蛋白提取主要受堿提pH值、堿提時(shí)間、堿提溫度和酸沉pH的影響。因此,以大豆分離蛋白提取率為考察指標(biāo),分別考察堿提pH(8,9,10,11,12)、堿提時(shí)間(40,50,60,70,80 min)、堿提溫度(30,40,50,60,70 ℃)和酸沉pH(2.5,3.5,4.5,5.5,6.5)對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響。

        1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大豆分離蛋白提取

        在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取堿提時(shí)間、堿提溫度、堿提pH、酸沉pH 4個(gè)變量為響應(yīng)因子,以大豆分離蛋白提取率為響應(yīng)值,采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[11-12]。分析各自變量對(duì)大豆分離蛋白提取率的顯著性,建立數(shù)學(xué)模型,進(jìn)行方差分析及回歸分析,確定堿提酸沉法提取大豆分離蛋白的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

        表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

        1.2.5 大豆分離蛋白酶解實(shí)驗(yàn)

        取大豆分離粗蛋白2.0 g,加入無(wú)菌水60 mL攪拌溶解,90 ℃水浴10 min滅菌,溫度降到室溫后用 1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.5,按4000 U/g加入酶,45 ℃水浴4 h,沸水浴20 min使酶滅活,7000 r/min離心15 min去沉淀,重復(fù)3次,上清液即為酶解液。復(fù)合酶解所用到的酶及其性質(zhì)見(jiàn)表2。

        表2 實(shí)驗(yàn)所用酶的性質(zhì)Table 2 The properties of the enzymes used in the test

        1.2.6 活性肽抑菌實(shí)驗(yàn)

        用牛津杯法測(cè)定活性肽的抑菌活性[13]。

        1.2.7 活性肽的抗氧化活性

        采用比色法進(jìn)行定量分析[14]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 大豆分離蛋白的提取優(yōu)化

        2.1.1 堿提pH值對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:堿提pH值對(duì)大豆分離蛋白提取率有較明顯的影響,見(jiàn)圖1。

        圖1 堿提pH對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of alkali extraction pH on extraction rate of soybean protein isolate

        由圖1可知,當(dāng)pH值為8~11時(shí),大豆分離蛋白的提取率隨著pH值的升高而升高,pH值為11時(shí)提取率最高,為28.15%。繼續(xù)增加pH值,提取率反而會(huì)下降,且下降較明顯。提取率在pH 9~11之間變化幅度較小,所以響應(yīng)面優(yōu)化中堿提pH值的變量選取9,10,11。

        2.1.2 堿提時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

        圖2 堿提時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of alkali extraction time on extraction rate of soybean protein isolate

        堿提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)的提取率有一定影響但不明顯,提取率數(shù)值變化幅度較小。由圖2可知在40~70 min時(shí),提取率緩慢上升;超過(guò)70 min后,蛋白質(zhì)提取率下降且下降幅度大,蛋白質(zhì)在堿提70 min左右達(dá)到平衡狀態(tài);超過(guò)70 min,則會(huì)浸出許多非蛋白質(zhì)物質(zhì),影響所得蛋白質(zhì)的純度,進(jìn)而影響蛋白提取效率,而且蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間處于堿性環(huán)境下自身質(zhì)會(huì)水解變性,蛋白提取效率也會(huì)下降。響應(yīng)面優(yōu)化蛋白質(zhì)堿提時(shí)間變量為50,60,70 min。

        2.1.3 堿提溫度對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

        堿提溫度對(duì)蛋白質(zhì)的提取率有一定影響,且影響也明顯。由圖3可知,隨著溫度不斷上升,蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),在30~50 ℃范圍內(nèi),蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速率不斷加快,大量蛋白質(zhì)分子進(jìn)入堿提液,蛋白質(zhì)提取率從27.25%提高到28.25%。溫度超過(guò)50 ℃后,蛋白質(zhì)提取率開(kāi)始降低,70 ℃時(shí)提取率為27.65%。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在高溫下變性,從而打破分子表面?zhèn)孺溁鶊F(tuán)與水分子相互作用力的平衡,堿提液的黏度增加,不利于蛋白質(zhì)的溶出[15]。響應(yīng)面優(yōu)化蛋白質(zhì)提取溫度選取40,50,60 ℃。

        圖3 堿提溫度對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of alkali extraction temperature on extraction rate of soybean protein isolate

        2.1.4 酸沉pH對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

        酸沉pH對(duì)大豆分離蛋白提取率有一定影響。由圖4可知,大豆分離蛋白在其等電點(diǎn)pH 4.5附近提取率最大,這是因?yàn)榇藭r(shí)大豆蛋白表面所攜帶的正、負(fù)電荷數(shù)量相差不大,呈電中性,蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力大大減弱,反而增強(qiáng)了與水分子之間的相互作用力,此時(shí)蛋白質(zhì)分子會(huì)聚集沉淀。此外在強(qiáng)酸條件下,肽鍵會(huì)被破壞,導(dǎo)致多肽鏈縮短,蛋白質(zhì)沉淀會(huì)逐漸消失,所以在pH為2.5時(shí),酸沉無(wú)沉淀。響應(yīng)面優(yōu)化蛋白質(zhì)酸沉pH變量為3.5,4.5,5.5。

        圖4 酸沉pH對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of acid precipitation pH on extraction rate of soybean protein isolate

        2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法中的Box-Behnken對(duì)大豆分離蛋白提取進(jìn)行優(yōu)化。在29個(gè)實(shí)驗(yàn)組合條件下,設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、預(yù)測(cè)值及結(jié)果Table 3 Response surface test design, predicted values and results

        續(xù) 表

        2.3 模型的建立與顯著性分析

        采用Design Expert 8.0軟件可得響應(yīng)值和被檢變量的邏輯關(guān)系。獲得大豆分離蛋白提取的二次多元回歸方程(Y)為:Y=28.32+2.55A+0.63B+0.17C-0.22D+0.4AB+0.18AC+0.36AD-0.33BC+0.11BD-0.075CD-1.61A2-1.57B2-0.32C2+6.67×10-3D2。

        利用軟件進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行分析以驗(yàn)證其有效性,模型的方差分析和顯著性分析見(jiàn)表4。

        表4 回歸方程方差分析和顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

        由表4方差分析結(jié)果可知,在該實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭校憫?yīng)值的決定系數(shù)(R2)為98.38%,表明蛋白質(zhì)提取率中有98.38%的變化可以使用該模型解釋。RAdj2=96.75%,表明大豆分離蛋白提取模型能在96.75%程度上解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果,僅有3.25%不能用該模型表示。失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),說(shuō)明該模型擬合度較好。其中P值越小,則表明該變量對(duì)提取率的影響越大:A與B的P值小于0.0001,C與D的P值大于0.05,由此可知影響蛋白提取率的主要因素是堿提pH值與酸沉pH值,而堿提時(shí)間、堿提溫度對(duì)大豆分離蛋白提取的影響較小。

        圖5 大豆分離蛋白影響因素三維響應(yīng)曲面圖Fig.5 Three-dimensional response surface diagrams of influencing factors of soybean protein isolate

        由圖5可知,隨著堿提溫度不斷上升、堿提時(shí)間增加,蛋白提取率都呈先升后降的趨勢(shì)且曲面變化幅度小,所以堿提溫度和堿提時(shí)間兩因素對(duì)蛋白提取率的影響很小。酸沉pH值不斷升高,蛋白提取率呈先升后降的趨勢(shì)且在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近達(dá)到最高點(diǎn),曲面整體變化幅度非常大,表明酸沉pH對(duì)蛋白提取率的影響很大。堿提pH值曲面變化幅度類(lèi)似酸沉pH值的變化幅度,又比堿提溫度、堿提時(shí)間的變化幅度略大。所以酸沉pH值與堿提pH值對(duì)黃豆中大豆分離蛋白提取率的影響最大,堿提溫度與堿提時(shí)間的影響最小。

        由此模型預(yù)測(cè)出大豆分離蛋白的最佳提取條件(見(jiàn)表5),理論上蛋白提取率可達(dá)29.65%,根據(jù)實(shí)際操作條件對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證(見(jiàn)表6),進(jìn)行3次平行試驗(yàn),實(shí)際蛋白提取率為29.25%,與預(yù)測(cè)值相差0.40%,因此該模型可以較準(zhǔn)確地確定大豆分離蛋白的最佳提取工藝。大豆分離蛋白含量約為40%,有文獻(xiàn)報(bào)道提取率達(dá)到70%以上[16],主要是因?yàn)樘崛÷识x不同,文獻(xiàn)提取率的定義是:提取的蛋白/原料中蛋白的含量,本研究中提取率為提取的蛋白重量/原料重量,如換算成文獻(xiàn)報(bào)道的提取率,應(yīng)該提取率也為75%左右。且文獻(xiàn)中大豆分離蛋白提取多為提取后離心沉淀產(chǎn)物,而本研究中大豆蛋白提取以后經(jīng)透析純化后冷凍干燥獲得,相對(duì)蛋白純度更高。

        表5 模型預(yù)測(cè)最佳提取條件

        表6 實(shí)際測(cè)定最佳提取條件Table 6 The optimal extraction conditions of actual determination

        2.4 復(fù)合酶解活性肽的抑菌活性

        采用牛津杯法測(cè)定大豆分離蛋白活性肽的抑菌活性,結(jié)果顯示:用胰蛋白酶和糜蛋白酶單獨(dú)酶解制備的活性肽對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、蠟樣芽孢桿菌均有抑菌活性,且活性大小差不多,而同時(shí)采用兩種酶復(fù)合酶解制備的活性肽抑菌活性比兩種酶單獨(dú)酶解制備的活性肽都要強(qiáng),說(shuō)明兩種酶復(fù)合酶解能制備活性更高的活性肽,見(jiàn)圖6。

        圖6 3種酶解液抑菌活性對(duì)比Fig.6 Comparison of antibacterial activities of three hydrolysates

        2.5 復(fù)合酶酶解活性肽的抗氧化活性

        測(cè)定兩種酶單酶酶解活性肽和復(fù)合酶酶解活性肽結(jié)果顯示都有一定的抗氧化活性,且復(fù)合酶酶解制備的活性肽抗氧化活性最高,對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到30.4%,見(jiàn)表7。

        表7 3種酶解活性肽抗氧化能力測(cè)定Table 7 The determination of antioxidant capacity of three enzymatic active peptides

        目前關(guān)于大豆分離蛋白活性肽抗氧化活性的報(bào)道不少,如孫莉莉等[17]采用堿性蛋白酶制備大豆活性肽并研究了其抗氧化活性,其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力達(dá)到41.2%,但該抗菌肽是經(jīng)過(guò)分離純化的,所以本研究復(fù)合酶酶解制備的活性肽抗氧化活性高低還需要進(jìn)一步深入詳細(xì)的比較研究才能確定。

        3 結(jié)論

        經(jīng)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化法確定大豆堿提酸沉法蛋白最佳提取工藝為堿提時(shí)間60 min、堿提溫度60 ℃、堿提pH值11.0、酸沉pH值5.0,最佳提取工藝提取大豆分離蛋白提取率為29.25%。采用胰蛋白酶、糜蛋白酶復(fù)合酶解法獲得對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、蠟樣芽孢桿菌具有較高抑菌活性的大豆分離蛋白活性肽,且該活性肽對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到37.5%,具有一定的抗氧化活性。該法制備的活性肽有望開(kāi)發(fā)新型營(yíng)養(yǎng)保健食品,或作為食品添加劑添加到其他食品中起到防腐保鮮和營(yíng)養(yǎng)保健的功效,開(kāi)發(fā)功能性食品。

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