李香荷 張冬 王強(qiáng) 王韻 田蘭 高燕霞

(河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050200)

克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate)為化學(xué)半合成的克林霉素前藥，在體外無(wú)抗菌活性，進(jìn)入機(jī)體后在堿性磷酸酯酶作用下水解為克林霉素而發(fā)揮抗菌活性[1]?？肆置顾刈饔糜诿舾芯颂求w的50 S亞基，抑制細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，可作為對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素過(guò)敏時(shí)的替代藥物[2]。臨床主要用于治療革蘭陽(yáng)性菌所致的呼吸道、耳鼻喉系統(tǒng)、皮膚軟組織、泌尿系統(tǒng)等感染，還可用于厭氧菌引起的各種感染性疾病。不良反應(yīng)主要為腎功能損害和血尿。

克林霉素磷酸酯注射液為美國(guó)法瑪西亞普強(qiáng)公司(Pharmacia and Upjohn Company，即現(xiàn)在的輝瑞制藥)研發(fā)，在1982年上市，其規(guī)格為2 mL:0.3 g。1994年，華北制藥廠的仿制藥被批準(zhǔn)在國(guó)內(nèi)上市。目前克林霉素磷酸酯制劑國(guó)產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)258個(gè)，劑型包括：膠囊劑、片劑、注射劑、凝膠劑、栓劑和陰道乳膏劑。注射用克林霉素磷酸酯批準(zhǔn)文號(hào)103個(gè)，生產(chǎn)企業(yè)36家，規(guī)格有：0.15、0.25、0.3、0.4、0.45、0.5、0.6、0.75、0.9和1.2 g。

克林霉素磷酸酯原料藥收載于《中國(guó)藥典》2020版、USP44、EP11.0、BP2021和JP2021，注射用粉針劑各國(guó)藥典均未收載。目前國(guó)內(nèi)執(zhí)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)有：WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017、WS1-(X-526)-2003Z-2010、YBH02202016、YBH00802012、YBH03602014、YBH02292015等。2021年，該品種被列為國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種。共抽取142批次，涉及21個(gè)生產(chǎn)企業(yè)和38個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，見(jiàn)表1。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道[3-9]，通過(guò)對(duì)國(guó)產(chǎn)注射用克林霉素磷酸酯的法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)及探索性研究，以問(wèn)題為導(dǎo)向，以提高藥品質(zhì)量為目標(biāo)，對(duì)該品種藥品進(jìn)行全面質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表1 抽樣情況表Tab.1 Table of samping

1 材料與方法

1.1 儀器

島津離子阱飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫1260高效液相色譜儀；梅特勒XS125分析天平，XSPBM-3CA 顯微鏡，布魯克D2 Phaser X射線衍射儀。

1.2 試藥

克林霉素磷酸酯對(duì)照品(中檢院提供，批號(hào)130486-201805，含量82.7%)；醋酸銨、甲醇、乙腈均為色譜純(Fisher chemical)，其余試劑為分析純。

142批次注射用克林霉素磷酸酯為2021年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，規(guī)格分別為0.3、0.45、0.5、0.6、0.75和0.9 g/支。其中3個(gè)企業(yè)采用無(wú)菌分裝工藝，共抽樣19批，18個(gè)企業(yè)采用無(wú)菌凍干工藝，共抽樣123批，調(diào)研收集到19個(gè)企業(yè)的原料和輔料，其對(duì)應(yīng)的原料涉及6家企業(yè)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 法定檢驗(yàn)

按產(chǎn)品說(shuō)明書上對(duì)應(yīng)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)142批次注射用克林霉素磷酸酯進(jìn)行法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，主要評(píng)價(jià)項(xiàng)目為有關(guān)物質(zhì)、水分、溶液的澄清度與顏色、酸度和含量測(cè)定。

2.2 HPLC法分析有關(guān)物質(zhì)

色譜條件：色譜柱為島津Shim-pack C18柱(規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：pH6.0磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀13.6 g，加水1000 mL使溶解，用0.45 mg/mL氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)-乙腈(79:21，V/V)，流動(dòng)相B：pH6.0磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀13.6 g，加水1000 mL使溶解，用0.45 mg/mL氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)-乙腈(40:60，V/V)，先以流動(dòng)相A等度洗脫，待克林霉素磷酸酯峰洗脫完畢后立即按表2線性梯度洗脫；流速：1.1 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

2.3 LC-MS分析雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

液相色譜條件：色譜柱為島津Shim-pack C18柱(規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：0.036 mol/L乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.0)，流動(dòng)相B：乙腈；按表3線性梯度洗脫；柱溫35 ℃；流速：1.0 mL/min(柱后分流比為7:3，V/V)；進(jìn)樣體積20 μL。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：離子源：ESI(+)；檢測(cè)電壓：1.54 kV；CDL溫度：200℃；脫溶劑管溫度：200℃。

2.4 HPLC含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱為島津Shim-pack C18柱(規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：pH6.0磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀13.6 g，加水1000 mL使溶解，用0.45 mg/mL氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)-乙腈(79:21，V/V)；柱溫：35℃；流速：1.1 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)

依據(jù)法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，142批次抽樣，全部符合規(guī)定，合格率為100%。對(duì)與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)的主要檢驗(yàn)項(xiàng)目如有關(guān)物質(zhì)、水分、溶液的澄清度與顏色、酸度和含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.1.1 有關(guān)物質(zhì)

現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法及限度差異較大。比較其差異：WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017、YBH03602014(B企業(yè) 0.3 g)和YBH02292015(D企業(yè))標(biāo)準(zhǔn)，采用梯度系統(tǒng)(色譜系統(tǒng)相同)，YBH02202016(A企業(yè))、WS1-(X-526)-2003Z-2010(B企業(yè)0.6 g)標(biāo)準(zhǔn)采用等度法。在限度方面，差異主要集中于對(duì)已知雜質(zhì)的控制，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017僅控制林可霉素、克林霉素兩個(gè)已知雜質(zhì)；YBH02202016(A企業(yè))控制了7個(gè)已知雜質(zhì)；YBH02292015(D企業(yè))控制了8個(gè)已知雜質(zhì)；YBH03602014(B企業(yè)0.3 g)控制了4個(gè)已知雜質(zhì)，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-526)-2003Z-2010(B企業(yè)0.6g)未控制已知雜質(zhì)，僅控制了單雜和總雜。

139批次中均未檢出林可霉素，克林霉素含量為0～0.6%，其他單雜含量為0.01%～1.4%，其他總雜含量為0.1%～3.6%；不同工藝產(chǎn)品之間雜質(zhì)差異較大(圖1)，其中企業(yè)A、B和C 3家無(wú)菌分裝產(chǎn)品，克林霉素含量均值分別為0.015%、0.10%和0.08%、其他單雜含量均值分別為0.03%、0.11%和0.38%，其他總雜含量均值分別為0.11%、0.30%和0.62%；M企業(yè)(凍干工藝)產(chǎn)品雜質(zhì)含量最高，克林霉素含量為0.6%、其他單雜含量為1.2%，其他總雜含量為3.1%。采用無(wú)菌分裝的3家企業(yè)產(chǎn)品無(wú)論單個(gè)雜質(zhì)還是雜質(zhì)總量均遠(yuǎn)低于凍干工藝產(chǎn)品。

圖1 有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The standard test results for related substances

同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次產(chǎn)品之間亦存在一定的差異。統(tǒng)計(jì)同企業(yè)3批次以上的產(chǎn)品結(jié)果，其他總雜含量差異最大的產(chǎn)品來(lái)自A、B、O、H和T企業(yè)，其中A和B的產(chǎn)品(無(wú)菌分裝品)，由于其雜質(zhì)含量本身較低，使得批間的RSD相對(duì)較大；O、H和T企業(yè)產(chǎn)品(無(wú)菌凍干品)，由于穩(wěn)定性較差，其雜質(zhì)含量與貯存時(shí)間呈正相關(guān)(P＜0.05)，貯存時(shí)間的差異導(dǎo)致批間雜質(zhì)含量差異較大，使得RSD值偏大。

此外，現(xiàn)行質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的差異使得測(cè)定結(jié)果可比性不強(qiáng)。從測(cè)定結(jié)果看，不同分析方法造成雜質(zhì)總量的極差可高達(dá)3.5%，說(shuō)明該品種有關(guān)物質(zhì)控制方法亟待規(guī)范統(tǒng)一。

3.1.2 水分

各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的水分限度不統(tǒng)一。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017和YBH03602014(B企業(yè))均規(guī)定“水分不得過(guò)1.5%”，YBH02202016(A企業(yè))規(guī)定“水分不得過(guò)6.0%”，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-526)-2003Z-2010(B企業(yè)0.6g)規(guī)定“水分不得過(guò)1.3%”。

142批次樣品采用費(fèi)休氏法測(cè)定水分，結(jié)果為0.2%～1.4%，均值為0.77%，企業(yè)間水分結(jié)果差異較大(圖2)，其中，A、B、C、K和R企業(yè)5家的產(chǎn)品水分含量均值較低，分別為0.4%、0.4%、0.5%、0.3%和0.3%；I、O、P和F企業(yè)4家的產(chǎn)品水分值較高，分別為1.2%、1.1%、1.2%和1.1%。3家無(wú)菌分裝工藝的產(chǎn)品水分含量明顯低于采用無(wú)菌凍干工藝的產(chǎn)品；不同企業(yè)凍干工藝產(chǎn)品的水分含量差異較大，其中E、O、S和T企業(yè)產(chǎn)品的批間差異較大，反映該企業(yè)凍干工藝穩(wěn)定性有待提高。

圖2 水分檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The result of moisture

3.1.3 溶液的澄清度與顏色

凍干工藝產(chǎn)品的檢測(cè)濃度為0.2 g/mL，無(wú)菌分裝產(chǎn)品的檢測(cè)濃度為0.04 g/mL；142批次產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，但檢測(cè)濃度的差異使得其結(jié)果不完全具有可比性。

檢驗(yàn)結(jié)果顯示，137批次產(chǎn)品澄清，5批次澄清度略顯渾濁，但淺于1號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液；140批次產(chǎn)品的溶液顏色為無(wú)色，S企業(yè)和J企業(yè)各1批產(chǎn)品顏色稍深，介于黃色1號(hào)與2號(hào)之間。

3.1.4 酸度

按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定。其中，123批次無(wú)菌凍干產(chǎn)品的pH值在6.2～6.8之間(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定pH值5.0～7.0)，19批次無(wú)菌分裝產(chǎn)品的pH值在3.7～4.4之間(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定pH值3.5～4.5)，同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次的酸度值均較為接近。

3.1.5 含量測(cè)定

按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)142批次樣品均符合規(guī)定。雖然不同標(biāo)準(zhǔn)中含量的限度有所差異，但從所有樣品的含量測(cè)定結(jié)果，按無(wú)水物計(jì)分布于76.4%～85.8%之間，均值為80.6%，極差9.4% ；按平均裝量計(jì)，含克林霉素為標(biāo)示量的94.0%～106.2%，均值為98.6%，極差12.2%；未發(fā)現(xiàn)低限投料的問(wèn)題。

對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)3批次以上產(chǎn)品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，批間含量差異最大的為B企業(yè)，變異系數(shù)為1.8%(按無(wú)水物計(jì))和3.5%(按平均裝量計(jì))，批間含量差異最小的為O企業(yè)，變異系數(shù)為0.6%(按無(wú)水物計(jì))和0.5%(按平均裝量計(jì))。

3.2 探索性研究

3.2.1 雜質(zhì)譜分析

采用新建立的雜質(zhì)譜分析方法共檢出13個(gè)雜質(zhì)，應(yīng)用LC-IT-TOF/MS技術(shù)，結(jié)合克林霉素磷酸酯EP系統(tǒng)適用性對(duì)照品、雜質(zhì)F(林可霉素2-磷酸酯)、雜質(zhì)G(2，4-磷酯酰林可霉素)、雜質(zhì)B(克林霉素B磷酸酯)對(duì)照品，中國(guó)藥品檢驗(yàn)研究院提供的雜質(zhì)A(林可霉素)和雜質(zhì)E(克林霉素)對(duì)照品，參考國(guó)外藥典，確證樣品中11個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)1為林可霉素2-磷酸酯，雜質(zhì)2為2，4-磷酯酰林可霉素，雜質(zhì)3為林可霉素，雜質(zhì)4為克林霉素2，4-二磷酸酯，雜質(zhì)5為克林霉素B磷酸酯，雜質(zhì)6為克林霉素2，3-二磷酸酯，雜質(zhì)7為7-表克林霉素磷酸酯，雜質(zhì)8為克林霉素(2R-順式)-非對(duì)映異構(gòu)體2磷酸鹽，雜質(zhì)9為3′(6′)-去氫克林霉素磷酸酯，雜質(zhì)10為克林霉素，雜質(zhì)11為克林霉素焦磷酸酯。各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見(jiàn)表4。

表4 各雜質(zhì)推定結(jié)構(gòu)及來(lái)源分析Tab.4 Structure and source analysis of peaks of related substances

續(xù)表4

利用強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)合LC-MS/ MS質(zhì)譜分析，探討產(chǎn)品中諸雜質(zhì)的來(lái)源。無(wú)菌凍干制劑中雜質(zhì)F和雜質(zhì)B的含量遠(yuǎn)高于原料，尤其是隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)雜質(zhì)含量顯著增加，提示其為貯存中的主要降解雜質(zhì)；克林霉素磷酸酯對(duì)酸較穩(wěn)定，在熱、堿、氧化和紫外條件下易產(chǎn)生雜質(zhì)F、G、E。

3.2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

比較EP11.0(BP2021與EP11.0方法及限度一致)、USP44和《中國(guó)藥典》2020年版克林霉素磷酸酯原料的有關(guān)物質(zhì)方法，初步認(rèn)為EP11.0收載的克林霉素磷酸酯有關(guān)物質(zhì)的分析方法較理想，以此為基礎(chǔ)對(duì)其梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化(圖3)，全部已知雜質(zhì)均可以良好分離。

圖3 優(yōu)化的有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜圖Fig.3 Optimized chromatogram of the related substances

按優(yōu)化方法檢驗(yàn)，142批次注射用粉針劑中，雜質(zhì)F在0.04%～1.5%之間，雜質(zhì)G在0.03%～0.4%之間，雜質(zhì)B在0.1%～1.8%之間，雜質(zhì)L在0.02%～0.6%之間，雜質(zhì)E在0.03%～0.8%之間，其他單一雜質(zhì)在0.1%～0.3%之間，雜質(zhì)總和在0.6%～5.5%之間。

參照EP11.0、克林霉素磷酸酯原研企業(yè)的限度，建議注射用克林霉素磷酸酯有關(guān)物質(zhì)限度為：雜質(zhì)F(相對(duì)保留時(shí)間為0.15)不得過(guò)3.0%、雜質(zhì)G(相對(duì)保留時(shí)間為0.20)不得過(guò)0.5%，雜質(zhì)B(相對(duì)保留時(shí)間0.45為)不得過(guò)1.5%，雜質(zhì)L(相對(duì)保留時(shí)間為0.63)不得過(guò)0.8%、雜質(zhì)E(相對(duì)保留時(shí)間為1.7)不得過(guò)1.5%，其他單一雜質(zhì)不得過(guò)0.5%，雜質(zhì)總和不得過(guò)6.0%。142批次注射用克林霉素磷酸酯中，僅3批次近效期的冷凍干燥產(chǎn)品(分別來(lái)自H、T和F企業(yè))達(dá)不到上述要求(圖4)。

圖4 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果單值圖Fig.4 The results of related substances

3.2.3 含量測(cè)定方法的改進(jìn)

法定標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定方法均采用C8色譜系統(tǒng)，但流動(dòng)相系統(tǒng)與有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的流動(dòng)相完全不同，結(jié)果雜質(zhì)A(相對(duì)保留時(shí)間為0.97)與克林霉素磷酸酯主峰之間與不能達(dá)到完全分離(圖5)，采用上述優(yōu)化的有關(guān)物質(zhì)分析方法測(cè)定克林霉素磷酸酯的含量，諸雜質(zhì)及輔料和溶劑均不干擾測(cè)定。142批次樣品按優(yōu)化后色譜系統(tǒng)檢驗(yàn)，結(jié)果與法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果相比，差異較小(圖6)，但結(jié)果的穩(wěn)定性更好。

圖5 法定標(biāo)準(zhǔn)典型色譜圖Fig.5 The typical chromatogram with legal standard

圖6 含量測(cè)定結(jié)果比較Fig.6 Comparison chart of assay results

3.2.4 原料晶型比較

目前國(guó)內(nèi)克林霉素磷酸酯原料藥生產(chǎn)廠家為10個(gè)，調(diào)研共收集到其中6個(gè)企業(yè)(A1～A6企業(yè))的原料。采用顯微鏡觀察法對(duì)6個(gè)企業(yè)原料晶型進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果 A1企業(yè)的晶粒規(guī)整，有六邊形板狀和不規(guī)整狀，細(xì)晶少，A2、A3和A4企業(yè)的晶粒為長(zhǎng)方體板狀，A5和A6企業(yè)的晶粒較小，且晶體粒徑大小不一(圖7)。

圖7 克林霉素磷酸酯原料晶型圖Fig.7 The pictures of clindamycin phosphate

采用X-粉末衍射法對(duì)6家企業(yè)的原料進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)A6企業(yè)的原料X-粉末衍射圖峰形和其他5家企業(yè)有一定差異。提示不同原料藥企業(yè)的結(jié)晶工藝存在差異。3家采用無(wú)菌分裝工藝生產(chǎn)的企業(yè)所用原料均來(lái)自A1和A6企業(yè)；采用凍干工藝的產(chǎn)品原料來(lái)自其他4家原料企業(yè)，有的制劑企業(yè)未固定原料供應(yīng)商(使用2～3家供應(yīng)商的原料)。由于結(jié)晶工藝可直接影響原料的雜質(zhì)譜，采用不同供應(yīng)商的原料藥生產(chǎn)制劑，可能是導(dǎo)致制劑雜質(zhì)譜變異的原因之一。

評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，采用無(wú)菌分裝工藝生產(chǎn)的制劑，從雜質(zhì)控制角度明顯優(yōu)于冷凍干燥工藝制劑。但另一方面，從注射劑無(wú)菌保障水平角度，冷凍干燥工藝較無(wú)菌分裝工藝在制劑過(guò)程更易控制產(chǎn)品的污染。對(duì)該類產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的評(píng)價(jià)將是國(guó)內(nèi)仿制藥一致性評(píng)價(jià)/再評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。