王松 張丹丹 趙海云 于明艷 楊蕙如 陳德俊

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250101)

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀是臨床上常用的由青霉素類抗生素與酶抑制劑組成的復(fù)方制劑，兩者合用可有效保護(hù)阿莫西林免遭β-內(nèi)酰胺酶水解[1]，本品適用于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的敏感菌所致的上呼吸道、下呼吸道、泌尿系統(tǒng)及皮膚和軟組織感染；不良反應(yīng)表現(xiàn)主要為皮膚、胃腸、神經(jīng)系統(tǒng)、用藥部位、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)損害、免疫功能紊亂和感染。

1985年，注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀由葛蘭素史克在英國上市；2013年原研產(chǎn)品進(jìn)口至國內(nèi)，商品名為Augmentin?。根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局藥品數(shù)據(jù)信息，目前國內(nèi)共有注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀生產(chǎn)企業(yè)31家，批準(zhǔn)文號60個，規(guī)格為1.2、0.6和0.3 g。本品為阿莫西林鈉與克拉維酸鉀按標(biāo)示量5:1均勻混合制成的無菌粉末，不含輔料。

2021年，注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀被列為國家藥品評價性抽檢品種。從全國31個省(區(qū)、市)共抽到212批次樣品，涉及21家生產(chǎn)企業(yè)。其主要執(zhí)行中國藥典2020年版標(biāo)準(zhǔn)，另有2家企業(yè)執(zhí)行國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(YBH06162017與YBH05672010)；國外僅英國藥典(BP2020)收載該品種。為客觀評價藥品質(zhì)量現(xiàn)狀，挖掘影響產(chǎn)品質(zhì)量的風(fēng)險點(diǎn)，本文按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對全部抽檢樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果對相關(guān)指標(biāo)開展了探索性研究，并對執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)工藝等方面提出改進(jìn)建議。

1 儀器與試藥

Q-Exactive Plus四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀；Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀；F-7000熒光分光光度計；布魯克D8 X射線粉末衍射儀；MS 2000激光衍射粒度分析儀；ZEISS Sigma 300熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡；Thermo ICS-5000離子色譜儀；ptiVeripac 455真空衰減測試儀。

212批次注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀為2021年度國家藥品評價性抽驗(yàn)樣品；1批次參比制劑(GSK，批號：SR2M)；硫酸奎寧(BP，批號4159)。甲醇、乙腈、甲酸和甲烷磺酸均為色譜純，磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、磷酸和鹽酸均為分析純，水為超純水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)

按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，主要檢測項目包含堿度、溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、水分、不溶性微粒及含量測定。

2.2 探索性研究

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)及雜質(zhì)譜研究

有關(guān)物質(zhì)檢查采用Thermo ODS-2 Hypersil色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)，流動相B：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)-甲醇(50:50，V/V)，線性梯度洗脫(0～10 min，B為2%；10～25 min，B為2%→29%；25～35 min，B為29%；35～50 min，B為29%→46%；50～60 min，B為46%；60～75 min，B為46%→65%；75～85 min，B為65%)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為20 μL。

采用LC-MS柱切換技術(shù)快速確證雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。一維色譜條件為有關(guān)物質(zhì)檢查色譜條件，僅進(jìn)樣體積增至80 μL。二維色譜條件：采用Thermo Hypersil GOLD色譜柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)；以1%甲酸溶液為流動相A，以1%甲酸的乙腈溶液為流動相B；自切峰后線性梯度洗脫(0～5 min，B為0；5～20 min，B為0→80%；20～35 min，B為80%)；柱溫：室溫；流速：0.5 mL/min；切換用定量環(huán)體積500 μL。質(zhì)譜條件：正離子化模式ESI(+)，噴霧電壓為3.0 kV，毛細(xì)管溫度為320℃，鞘氣流量為35 arb，輔助氣流量為10 arb，掃描方式Full MS/dd-MS2模式，掃描范圍為m/z100～1500，碰撞能量分別為NCE10、20和30 V。

2.2.2 單組分原料及制劑中克拉維酸聚合物及其他熒光雜質(zhì)研究

取本品適量(約相當(dāng)于克拉維酸0.1 g)，制成每1 mL中約含1 mg的溶液；取硫酸奎寧對照品適量，制成每1 mL中約含0.42 μg的溶液。取供試品溶液與對照品溶液，在激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長440 nm處分別測定熒光強(qiáng)度。

2.2.3 復(fù)溶行為

復(fù)溶時間取各企業(yè)樣品5瓶，根據(jù)西林瓶體積大小分別注入注射用水10或5 mL，振搖觀察并用秒表計時。

粒度與粒度分布采用激光粒度測定法，干法測試，顆粒折射率：1.52；顆粒吸收率：0.1；進(jìn)樣口寬度：4 mm；進(jìn)樣速率：50%；分散氣壓：1.0 bar；遮光度：0.5%～5%。

2.2.4 成鹽率考察

用陽離子交換色譜柱(IonPac CS12A柱)；檢測器為電導(dǎo)檢測器；檢測方式為抑制電導(dǎo)檢測；柱溫為35℃；以6.7 mmol/L甲烷磺酸溶液為淋洗液，流速為1 mL/min，抑制器電流值為20 mA；進(jìn)樣體積25 μL。

2.2.5 包材密封性研究

真空衰減法：測試壓力35 mbar；抽真空時間12.0 s；測試時間10.0 s；平衡時間10.0 s 。

3 結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗(yàn)結(jié)果

按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，212批注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀均符合規(guī)定，但有5批次樣品溶液的顏色在限度邊緣。

3.2 探索性研究結(jié)果

3.2.1 有關(guān)物質(zhì)及雜質(zhì)譜研究

β-內(nèi)酰胺類抗生素自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，產(chǎn)品中有機(jī)雜質(zhì)種類復(fù)雜且微量[2]，基于β-內(nèi)酰胺類抗生素的質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合降解反應(yīng)原理，推斷其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)是常用的方法之一[3]。采用柱切換-LC/MS技術(shù)，按照優(yōu)化后的有關(guān)物質(zhì)方法，對注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和來源分析[4-6]，共推斷出15個雜質(zhì)(圖1)，均為阿莫西林雜質(zhì)，其中9個在EP中收載，2個在中文獻(xiàn)報道(雜質(zhì)7和9)，4個雜質(zhì)(雜質(zhì)3、5、12和13)未見報道(表1)。

表1 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及來源分析Tab.1 The structure and source analysis of impurities

圖1 注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀樣品降解溶液典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of the sample degradation solution

目前國內(nèi)阿莫西林鈉克拉維酸鉀原料生產(chǎn)企業(yè)有3家，A企業(yè)和C企業(yè)樣品中檢出11號雜質(zhì)，B企業(yè)樣品中檢出8號雜質(zhì)。分析雜質(zhì)譜差異的原因，不同企業(yè)在阿莫西林復(fù)溶成鹽過程中選用的溶媒不同，A企業(yè)和C企業(yè)采用乙醇為溶媒，B企業(yè)使用了甲醇，故其工藝雜質(zhì)分別為阿莫西林青霉噻唑酸乙酯和阿莫西林青霉噻唑酸甲酯。

14號雜質(zhì)(阿莫西林閉環(huán)二聚體)作為本品中的最大雜質(zhì)，BP2020對其進(jìn)行了單獨(dú)控制。通過優(yōu)化的有關(guān)物質(zhì)分析方法，可分離到阿莫西林閉環(huán)二聚體、開環(huán)二聚體、閉環(huán)三聚體以及阿莫西林與相關(guān)雜質(zhì)的聚合產(chǎn)物，提示優(yōu)化方法可有效監(jiān)測各類聚合物雜質(zhì)。文獻(xiàn)報道[7]，阿莫西林閉環(huán)二聚體的含量與阿莫西林閉環(huán)三聚體的含量呈正相關(guān)，可將該雜質(zhì)作為聚合物的指標(biāo)性雜質(zhì)進(jìn)行控制。

選取原料來源不同的3家企業(yè)樣品，于溫度40℃、相對濕度75%條件下進(jìn)行3個月的加速試驗(yàn)(圖2)，結(jié)果可見，阿莫西林雜質(zhì)D2、雜質(zhì)C及雜質(zhì)總量均呈顯著增長趨勢。值得注意的是，A企業(yè)和C企業(yè)樣品中主要降解雜質(zhì)增長趨勢較B企業(yè)樣品明顯不同。水分測定結(jié)果顯示，B企業(yè)樣品的水分值最低，推測水分有利于阿莫西林鈉的降解。

圖2 樣品雜質(zhì)變化趨勢圖Fig.2 Trend diagram of sample related substances

采用ADMET predictor軟件對阿莫西林諸雜質(zhì)的毒性進(jìn)行預(yù)測。軟件提示，雜質(zhì)3、7、9、12和13在大鼠中有致癌性。根據(jù)ICHM7指導(dǎo)原則要求，進(jìn)一步采用Derek Nexus:6.1.1(基于知識規(guī)則)和SarahNexus：3.1.1(基于統(tǒng)計學(xué))對阿莫西林雜質(zhì)進(jìn)行遺傳毒性評價，阿莫西林相關(guān)雜質(zhì)結(jié)果均為陰性。上述結(jié)果提示，阿莫西林的相關(guān)雜質(zhì)均為普通雜質(zhì)。

3.2.2 克拉維酸原料及制劑中克拉維酸聚合物及其他熒光雜質(zhì)分析

上述雜質(zhì)譜分析中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)雜質(zhì)均來源于阿莫西林鈉，參考BP2020中的檢查項目，采用熒光分光光度法對克拉維酸鉀原料及制劑中克拉維酸聚合物及其他熒光雜質(zhì)進(jìn)行分析，進(jìn)而揭示制劑中克拉維酸鉀的雜質(zhì)水平。

熒光雜質(zhì)分析結(jié)果顯示，E企業(yè)和F企業(yè)樣品中該類雜質(zhì)含量最高(表2)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，克拉維酸聚合物及其他熒光雜質(zhì)含量與溶液的顏色呈顯著正相關(guān)。提示熒光雜質(zhì)可能是引起本品溶液顏色加深的原因之一。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，顏色較深的樣品均抽自經(jīng)營單位；E企業(yè)中的1批樣品顏色淺于2號標(biāo)準(zhǔn)比色液，為抽自該生產(chǎn)單位的成品倉庫樣品，同時生產(chǎn)日期較新。提示熒光雜質(zhì)可能與藥品的運(yùn)輸和儲存條件有關(guān)。

表2 部分檢測項目結(jié)果比較Tab.2 Comparison of results of some test items

續(xù)表1

選取3家原料來源企業(yè)的樣品于高溫(60℃)、高濕(92.5%，溫度25℃)及強(qiáng)光照射(4500 Lx)環(huán)境下放置5和10 d，進(jìn)行影響因素試驗(yàn)(圖3)，結(jié)果表明，高濕和光照條件下雜質(zhì)穩(wěn)定，溶液的顏色未加深；高溫條件下，克拉維酸雜質(zhì)含量增長明顯，溶液的顏色顯著加深，提示在包裝條件下，溫度是影響本品質(zhì)量變化的關(guān)鍵因素。

圖3 影響因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of influencing factor test

3.2.3 復(fù)溶行為

復(fù)溶與藥物的臨床應(yīng)用息息相關(guān)，是注射用粉針劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性[8]。比較國內(nèi)產(chǎn)品和原研產(chǎn)品復(fù)溶行為的差異，參比制劑在12 s內(nèi)全部溶解，國內(nèi)樣品復(fù)溶時間在7～26 s之間。復(fù)溶時間較快的樣品，所用西林瓶體積為25 mL，大于參比制劑西林瓶體積(20 mL)。復(fù)溶時間較慢的樣品，西林瓶體積均小于參比制劑，部分企業(yè)樣品僅能加入5 mL注射用水。提示制劑西林瓶的體積是影響復(fù)溶行為的關(guān)鍵因素之一。本品溶液的穩(wěn)定性與濃度有關(guān)，濃度越高，溶液越不穩(wěn)定[9-11]；參比制劑的說明書中亦有提示?？梢姡x用小規(guī)格西林瓶不僅不利于樣品的溶解；且可能因復(fù)溶后濃度較高影響溶液的穩(wěn)定性。

進(jìn)一步比較參比制劑和不同原料來源的國產(chǎn)制劑晶體特征的異同。參比制劑與不同國產(chǎn)制劑的X射線粉末衍射圖譜相同，均僅含有兩組分的特征衍射峰；采用激光散射粒度分布儀比較其粒度與粒度分布，參比制劑的粒徑d(0.5)約為7 μm，C企業(yè)樣品稍大約為9 μm，A企業(yè)和B企業(yè)樣品基本一致，在12 μm左右；繼續(xù)使用掃描電鏡對各企業(yè)樣品粉末的微觀形態(tài)進(jìn)行分析(圖4)，可見，阿莫西林鈉呈細(xì)小塊狀結(jié)構(gòu)，為主要成分，少量克拉維酸鉀為明顯短棒狀結(jié)構(gòu)；阿莫西林鈉顆粒大小存在顯著差異，參比制劑中阿莫西林鈉的粒徑基本在10 μm以下?？梢?，制劑中主成分的結(jié)晶形態(tài)存在一定的差異，提示其結(jié)晶工藝不同。進(jìn)一步探討阿莫西林鈉結(jié)晶工藝與產(chǎn)品質(zhì)量與療效的關(guān)系，將促使國產(chǎn)制劑質(zhì)量的持續(xù)提高。

圖4 不同企業(yè)樣品的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy image of the samples

3.2.4 成鹽率考察

測定部分抽檢樣品的成鹽率，阿莫西林鈉在1.00～1.13之間，克拉維酸鉀在0.94～1.05之間，成鹽情況較好。進(jìn)一步關(guān)注工藝過程中使用的成鹽劑，發(fā)現(xiàn)3家原料企業(yè)的成鹽劑均為2-乙基己酸鈉或2-乙基己酸鉀。參照ChP2020四部通則對2-乙基己酸進(jìn)行測定，來源于C企業(yè)原料的樣品，2-乙基己酸的殘留量為0.39%～0.51%，其含量相對較高，提示其成鹽工藝需進(jìn)一步優(yōu)化。

3.2.5 包材密封性研究

在法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)部分企業(yè)產(chǎn)品溶液的顏色較深，相同原料來源，不同制劑企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量存在差異(表2)。采用真空衰減法，對質(zhì)量相對較差的E企業(yè)和F企業(yè)樣品與包裝材質(zhì)相近、尺寸相同整體質(zhì)量較好的Q和A企業(yè)樣品進(jìn)行比較，探討包材密封性對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

測定結(jié)果顯示，E企業(yè)和F企業(yè)樣品的壓差均值分別大于Q企業(yè)和A企業(yè)樣品的結(jié)果，而且離散程度大。Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析表明，上述企業(yè)樣品存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；單變量顯著性分析表明，E企業(yè)4批樣品中的3批與Q、F與A企業(yè)樣品結(jié)果均存在顯著性差異(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，存在顯著性差異的樣品均抽自經(jīng)營單位，E企業(yè)1批無顯著性差異的樣品，抽自該生產(chǎn)單位的成品倉庫，未經(jīng)流通運(yùn)輸，同時生產(chǎn)日期也較新。提示包裝的密封完整性差異可能是導(dǎo)致不同企業(yè)樣品質(zhì)量差異的原因之一。

4 結(jié)論

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀為混粉原料無菌分裝，未添加輔料，原料質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響制劑質(zhì)量。全國抽驗(yàn)結(jié)果顯示，注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀總體質(zhì)量較好，但其在原料工藝中的細(xì)微差異，如阿莫西林鈉結(jié)晶工藝的差異，阿莫西林鈉和克拉維酸鉀成鹽工藝的差異等，將影響產(chǎn)品的雜質(zhì)譜等與參比制劑存在差異，對其工藝過程細(xì)節(jié)的持續(xù)優(yōu)化，將有助于國產(chǎn)制劑質(zhì)量的持續(xù)提高。

本品在運(yùn)輸和儲存條件溶液的顏色易變深，其與克拉維酸鉀降解產(chǎn)生的熒光類雜質(zhì)的含量呈顯著正相關(guān)，并可能與產(chǎn)品包裝的密閉性有關(guān)。進(jìn)一步探討克拉維酸鉀降解反應(yīng)與溶液顏色變化的規(guī)律，有望解決導(dǎo)致其易變色原因這一難題。

探索性研究結(jié)果提示，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待改進(jìn)。建議阿莫西林有關(guān)物質(zhì)項下對主要降解雜質(zhì)、關(guān)鍵工藝雜質(zhì)和聚合物指標(biāo)性雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)控，增加雜質(zhì)校正因子，增訂克拉維酸聚合物及其他熒光雜質(zhì)檢查項。