符雅楠 李進(jìn) 尹利輝，* 馮芳 姚尚辰 許明哲

(1 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；2 中國(guó)藥科大學(xué)，南京 211198)

據(jù)國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)年度報(bào)告[1]、北京藥物警戒[2](BPD)和解放軍藥品不良反應(yīng)報(bào)告[3]等數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，近幾年來(lái)抗生素類藥物依舊被歸于藥源性過(guò)敏反應(yīng)(DIA)發(fā)生中的最常見(jiàn)的原因。其中，β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)過(guò)敏反應(yīng)以頭孢菌素類抗生素為主，發(fā)生頻率最高。其原因可能為頭孢菌素類抗生素在國(guó)內(nèi)使用率更高，且頭孢菌素類抗生素的常規(guī)皮試測(cè)試敏感性低，可能不適用于預(yù)測(cè)即時(shí)的超敏反應(yīng)，因此頭孢菌素類抗生素的過(guò)敏反應(yīng)研究值得高度重視。頭孢菌素類抗生素不同于一些青霉素類抗生素，均是由天然頭孢菌素C經(jīng)側(cè)鏈等結(jié)構(gòu)改造形成的一系列半合成抗生素，因此，由發(fā)酵工藝中形成的蛋白結(jié)合物類大分子雜質(zhì)可不作為研究對(duì)象[4]，聚合物雜質(zhì)是引起其過(guò)敏的關(guān)鍵因素。

不同聚合程度的聚合物雜質(zhì)一般有著相似的生物學(xué)特性，均可作為多價(jià)半抗原引起IgE介導(dǎo)的I型速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，且聚合物雜質(zhì)的致敏性也會(huì)隨著聚合程度的增大而增強(qiáng)[5-6]。因此，在之前的研究中，研究者們多采取控制聚合物雜質(zhì)總量的方式對(duì)高分子聚合物雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，但隨著分離技術(shù)的快速發(fā)展、人們對(duì)聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)、反應(yīng)機(jī)理、裂解規(guī)律的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步加深，聚合物質(zhì)控的理論也已由總量控制發(fā)展為對(duì)指針性聚合物雜質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)控制[7]。指針性聚合物雜質(zhì)分析方法的建立目前需要運(yùn)用到二維液相色譜(2D-HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等分析技術(shù)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、工作量較大，聚合物雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備難度也較大，因此該類雜質(zhì)在質(zhì)控發(fā)展道路上還存在著一些挑戰(zhàn)。本文綜述了近年來(lái)該領(lǐng)域的發(fā)展，對(duì)頭孢菌素類抗生素聚合物質(zhì)控的分析方法、結(jié)構(gòu)研究等趨勢(shì)及進(jìn)展，提出了仍需進(jìn)一步思考和研究的問(wèn)題。

1 頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)的分析方法

1.1 葡聚糖凝膠G-10分子排阻色譜法(Sephadex G-10 SEC)

SEC法，又稱凝膠色譜法(GPC)，主要依據(jù)混合物分子量大小的差異預(yù)測(cè)分離，適用于對(duì)未知樣品的探索性分析。其中，β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)質(zhì)控的難點(diǎn)之一就是聚合物雜質(zhì)峰的識(shí)別問(wèn)題，我國(guó)曾首次采用自身對(duì)照外標(biāo)法定量，建立了Sephadex G-10凝膠色譜定量測(cè)定聚合物雜質(zhì)的研究方法[8]。采用葡聚糖凝膠G-10柱，利用β-內(nèi)酰胺類抗生素可于特定條件下，如水溶液中形成締合物，在凝膠色譜系統(tǒng)中產(chǎn)生和聚合物雜質(zhì)相似色譜行為的原理[9]，在雜質(zhì)控制過(guò)程中可免去標(biāo)準(zhǔn)品雜質(zhì)，較容易地控制聚合物雜質(zhì)的總量。高丹玲等[10]采用G-10凝膠色譜系統(tǒng)測(cè)定了注射用頭孢尼西鈉中的聚合物雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聚合物雜質(zhì)的有效分配系數(shù)(Kav)趨近于0，能完全排阻，驗(yàn)證了方法的可行性。陳霞等[11]對(duì)流動(dòng)相A中緩沖鹽濃度、pH和流動(dòng)相B中水溶液的組分進(jìn)行了方法學(xué)優(yōu)化，最終建立了G-10柱測(cè)定注射用復(fù)方頭孢西丁鈉中聚合物雜質(zhì)的分析方法。何建紅[12]在采用Sephadex G-10法分析注射用頭孢唑肟鈉聚合物雜質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥物濃度越高時(shí)，頭孢唑肟鈉中的聚合物雜質(zhì)峰面積雖然更高，但穩(wěn)定性更差，為保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要在配液后立即取樣檢測(cè)。

在采用葡聚糖G-10凝膠柱進(jìn)行分離分析時(shí)，所有聚合物雜質(zhì)在該色譜系統(tǒng)中均表現(xiàn)為單一的色譜峰，不具備區(qū)分不同分子量聚合物雜質(zhì)的能力，可能使得某些聚合物雜質(zhì)由于聚合程度小而與后面的小分子藥物峰重疊，難以辨別聚合物雜質(zhì)的存在[13]；此外，無(wú)論是對(duì)于劑型為干混懸劑、片劑、膠囊劑等可能添加藥用高分子輔料的頭孢菌素類抗生素藥物還是含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方制劑[11，14]，在運(yùn)用G-10柱分析時(shí)，藥用輔料和酶抑制劑都均有可能干擾聚合物雜質(zhì)的出峰情況。其次，該方法檢測(cè)靈敏度較低，進(jìn)樣所需的樣品濃度一般比較大，藥物主峰通常呈現(xiàn)一個(gè)超載的色譜峰，使得柱效極低。同時(shí)，一些頭孢菌素類抗生素在特定條件下還會(huì)出現(xiàn)無(wú)法完全締合的情況[15]，導(dǎo)致定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。

1.2 高效分子排阻色譜法(HPSEC)

HPSEC法采用以高效凝膠色譜填料作為填充劑的色譜柱進(jìn)行分離，靈敏度相對(duì)較高，不需要像Sephadex G-10柱凝膠色譜法一樣采用復(fù)雜的流動(dòng)相體系，操作簡(jiǎn)單，具備一定程度上區(qū)分不同分子量聚合物雜質(zhì)的能力。石海英等[16]選用TSK-Gel 2500PWXL柱測(cè)定了頭孢克肟干混懸劑中的聚合物雜質(zhì)，一定程度上解決了葡聚糖G-10色譜柱條件下由于其高分子助懸劑輔料的影響，聚合物雜質(zhì)峰無(wú)法與主峰完全分離的難題。曹靖等[17]建立了TSK gel G2000SWxl凝膠系統(tǒng)分離分析頭孢克洛分散片聚合物雜質(zhì)的方法，克服了該品種在使用Sephadex G-10系統(tǒng)分析時(shí)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法完全在流動(dòng)相B中締合，需尋找合適對(duì)照品的問(wèn)題。張斗勝等[18]通過(guò)HPSEC法測(cè)定注射用鹽酸頭孢替安聚合物雜質(zhì)發(fā)現(xiàn)采用TSK凝膠系統(tǒng)除了根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離，還可根據(jù)化合物的極性進(jìn)行分離分析，具有類似液相色譜柱的功能。錢璟[19]在分析頭孢呋辛酯片聚合物雜質(zhì)時(shí)，由于該品具有脂溶性，在水中不溶，因而考慮采用流動(dòng)相含可與水完全互溶的有機(jī)溶劑的TSK-gel凝膠色譜系統(tǒng)，方法分離效果佳，也為該類脂溶性藥物提供了有效的聚合物質(zhì)控手段。孫玉雙等[20]建立了TSK凝膠色法測(cè)定頭孢丙烯干混懸劑中的聚合物雜質(zhì)含量，克服了Sephadex G-10系統(tǒng)對(duì)頭孢丙烯產(chǎn)生的吸附影響。李敏等[21]采用TSK gel G2000HHR柱經(jīng)篩選條件和方法學(xué)驗(yàn)證后建立了測(cè)定頭孢妥侖匹酯片中聚合物雜質(zhì)含量的方法，該方法能有效分離其聚合物雜質(zhì)。熊雯等[13]比較了以葡聚糖凝膠G-10和TSK gel G2000SWxl為填充劑的兩種不同的HPSEC法，測(cè)定了注射用頭孢地嗪鈉中聚合物雜質(zhì)的含量，結(jié)果表明后者專屬性好、靈敏度更高，能更全面地反映頭孢地嗪鈉中聚合物雜質(zhì)的情況。

HPSEC法雖然較好地克服了Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)的不足，但因具有相似的分離機(jī)制，聚合物雜質(zhì)峰易受到藥物中某些小分子雜質(zhì)及輔料等共出峰干擾，從而影響聚合物雜質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。并且，凝膠介質(zhì)除了具有分子排阻作用外，還會(huì)產(chǎn)生吸附、疏水等非排阻作用[22]，影響聚合物雜質(zhì)分離的專屬性。同時(shí)，還存在待分析化合物在高效分子排阻系統(tǒng)中的洗脫順序不一定完全按照相對(duì)分子質(zhì)量大小排列等問(wèn)題。因此，隨著HPSEC法的廣泛應(yīng)用，亟需對(duì)高效分子排阻色譜分離得到的聚合物雜質(zhì)峰的專屬性予以驗(yàn)證。

1.3 反相高效液相色譜法(RP-HPLC)

在RP-HPLC中，樣品組分根據(jù)極性大小相繼被洗脫。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相組成及性質(zhì)、色譜柱填充性能、柱溫、流速等參數(shù)，各組分保留時(shí)間、分離能力等將得到不同程度的改善，因此該法專屬性強(qiáng)、靈敏度高且定量準(zhǔn)確，應(yīng)是研究抗生素中聚合物雜質(zhì)的首選分析方法。王建等[23]通過(guò)建立HPLC-UV梯度洗脫的方法同時(shí)測(cè)定了鹽酸頭孢他美酯中的有關(guān)物質(zhì)和兩種二聚體雜質(zhì)。彭潔等[24]經(jīng)篩選后采用C8柱，建立了RP-HPLC對(duì)頭孢呋辛酯及其制劑中聚合物雜質(zhì)的測(cè)定，并對(duì)洗脫方式及磷酸鹽濃度等色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，方法專屬性強(qiáng)，聚合物雜質(zhì)能實(shí)現(xiàn)較好分離。李進(jìn)等[25]在進(jìn)行頭孢拉定原料及其制劑中的聚合物雜質(zhì)研究時(shí)，對(duì)比了HPSEC和RP-HPLC兩種方法。結(jié)果顯示，HPSEC法測(cè)定樣品中聚合物雜質(zhì)含量結(jié)果不準(zhǔn)確，而新建立的RP-HPLC法柱效更高、專屬性更強(qiáng)，適用于頭孢拉定原料及制劑的聚合物雜質(zhì)相關(guān)質(zhì)控，也為精準(zhǔn)控制β-內(nèi)酰胺類抗生素中的指針性聚合物雜質(zhì)的分析方法奠定了基礎(chǔ)。

但聚合物雜質(zhì)峰在RP-HPLC系統(tǒng)中較難定位，且聚合物雜質(zhì)極性一般弱于小分子雜質(zhì)，通常在色譜系統(tǒng)中洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，易出現(xiàn)漏檢的情況。因此，在利用RP-HPLC檢測(cè)聚合物雜質(zhì)時(shí)，方法開發(fā)方面存在著較大的難題。目前，大多數(shù)研究者在研究聚合物雜質(zhì)時(shí)通常參照藥典方法，查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，通過(guò)試錯(cuò)法或單因素變量法(OFAT)對(duì)影響分離的流動(dòng)相pH及緩沖鹽濃度、檢測(cè)波長(zhǎng)、強(qiáng)溶劑比例、洗脫時(shí)間等因素進(jìn)行比較摸索與優(yōu)化，最終建立相對(duì)合適的檢測(cè)方法。但傳統(tǒng)的方法開發(fā)通常只能比較幾個(gè)影響因素改變后產(chǎn)生的響應(yīng)，無(wú)法預(yù)測(cè)當(dāng)幾個(gè)參數(shù)同時(shí)發(fā)生波動(dòng)時(shí)可能存在的相互影響，也不能表征單一影響因素對(duì)分離結(jié)果的影響大小[26]，因此所建立的方法是否為最優(yōu)化尚未知曉。試驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)作為QbD應(yīng)用于HPLC分析方法的建立與驗(yàn)證的主要手段，可同時(shí)研究多個(gè)變量因素對(duì)分離分析方法的影響及交互作用[27]。其主要步驟首先為通過(guò)析因設(shè)計(jì)或經(jīng)驗(yàn)找到影響方法性能的關(guān)鍵方法因素為自變量，難分離雜質(zhì)的分離度、保留情況等直接影響分離結(jié)果的指標(biāo)為響應(yīng)因素后，再選擇合適的DOE設(shè)計(jì)模型對(duì)關(guān)鍵方法因素和響應(yīng)值進(jìn)行擬合，建立并評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸方程，從而找到“設(shè)計(jì)空間”范圍內(nèi)的參數(shù)最優(yōu)值[28]。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多研究者采用DOE方法開發(fā)優(yōu)化藥物的分析方法[29-33]，該試驗(yàn)方法可解決傳統(tǒng)液相分析方法開發(fā)存在的方法建立后可調(diào)控性低、方法開發(fā)效率及方法轉(zhuǎn)移等方面的問(wèn)題[34]，同時(shí)還可減少試驗(yàn)成本、縮短方法研發(fā)時(shí)間，將成為今后液相分析方法開發(fā)的一大趨勢(shì)。

2 頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)在國(guó)內(nèi)外藥典中的質(zhì)控研究現(xiàn)狀

2.1 中國(guó)藥典近年來(lái)對(duì)聚合物雜質(zhì)的質(zhì)控現(xiàn)狀

人們對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)的研究始于20世紀(jì)70年代，為了對(duì)該類聚合物雜質(zhì)進(jìn)行更有效的質(zhì)量控制，中國(guó)藥典從2000年版起采用葡聚糖凝膠Sephadex G-10法對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢哌酮鈉這4個(gè)品種的β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物雜質(zhì)制定了相應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。隨著近年來(lái)分析技術(shù)的迅速發(fā)展，中國(guó)藥典不斷更新并增補(bǔ)對(duì)不同β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物雜質(zhì)的控制。截至目前，《中國(guó)藥典》2020年版二部[35]中收載了包括青霉素類和頭孢菌素類抗生素在內(nèi)的一共40個(gè)品種。其中，收錄頭孢菌素類抗生素26個(gè)品種，48種制劑，已對(duì)其11個(gè)品種(如頭孢他啶、頭孢尼西鈉等)采用Sephadex G-10系統(tǒng)制定了聚合物雜質(zhì)的控制標(biāo)準(zhǔn)，2個(gè)品種(頭孢地嗪鈉、頭孢米諾鈉)采用高效凝膠色譜法控制聚合物雜質(zhì)。另外，對(duì)于頭孢泊肟酯和頭孢唑肟鈉這2個(gè)品種，最新版《中國(guó)藥典》(ChP2020)分別在有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下增加了系統(tǒng)適用性溶液的配制方法。其中，給出了頭孢泊肟酯特定雜質(zhì)的RP-HPLC參考色譜圖，包括頭孢泊肟酯二聚體及其異構(gòu)體雜質(zhì)；明確規(guī)定了頭孢唑肟鈉二聚體峰RP-HPLC法的相對(duì)保留時(shí)間，控制二聚體檢測(cè)限度為0.1%，這將有助于今后這兩類品種聚合物雜質(zhì)的定位及控制。

2.2 國(guó)外藥典的質(zhì)控現(xiàn)狀分析

目前，《歐洲藥典》第十版(EP 10.0)[36]和《英國(guó)藥典》2020年版(BP2020)[37]中分別收錄19和20種頭孢菌素類抗生素，并分別對(duì)頭孢西丁鈉、頭孢泊肟酯、頭孢噻肟鈉這3個(gè)品種進(jìn)行了含聚合物雜質(zhì)的質(zhì)量控制?！睹绹?guó)藥典》43版(USP 43)[38]中收載了32種頭孢菌素類抗生素，共對(duì)其中7個(gè)品種(頭孢丙烯、頭孢呋辛酯、頭孢羥氨芐、頭孢噻肟鈉、鹽酸頭孢吡肟、頭孢噻呋鈉、鹽酸頭孢噻呋)的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行了控制。從各國(guó)藥典方法中得知，國(guó)際上一般采用反相高效液相色譜梯度洗脫法對(duì)聚合物雜質(zhì)進(jìn)行控制，以相對(duì)保留時(shí)間對(duì)其進(jìn)行初步定位，將二聚體作為主要特定雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，但對(duì)于聚合物雜質(zhì)的質(zhì)控限度暫沒(méi)有規(guī)定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

表1 國(guó)外藥典控制聚合物雜質(zhì)的限度要求Tab.1 Limit requirements for polymer impurities in foreign pharmacopoeias

《中國(guó)藥典》收錄的采用葡聚糖G-10系統(tǒng)控制聚合物雜質(zhì)的方式填補(bǔ)了之前國(guó)際上聚合物雜質(zhì)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)空白，但目前看來(lái)，該法對(duì)各品種聚合物雜質(zhì)限度確定較為籠統(tǒng)，在實(shí)際藥品檢查中仍有需要解決的問(wèn)題[39]，將無(wú)法滿足今后質(zhì)控的需求。同時(shí)，后增補(bǔ)的高效凝膠色譜法雖在一定程度上提高了聚合物雜質(zhì)檢測(cè)的靈敏度，其方法專屬性也已逐漸受到質(zhì)疑[40-41]。在解決聚合物雜質(zhì)定位難題之后，RP-HPLC法將有望成為聚合物雜質(zhì)控制的主要分析方法。

2.3 原料藥及制劑在聚合物雜質(zhì)質(zhì)控中的異同及進(jìn)展

國(guó)內(nèi)外藥典收載的頭孢菌素類抗生素品種中，聚合物雜質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)多以原料藥和注射劑為主。原料藥成分單一較易控制，而注射劑劑型較為特殊，凍干藥品經(jīng)溶解后直接注射入人體組織或血管或器官內(nèi)吸收速度快，起效迅速。特別是靜脈注射，藥物可直接進(jìn)入血液循環(huán)，因聚合物雜質(zhì)而引發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)的幾率較其他制劑更大，需要嚴(yán)格控制該類制劑聚合物雜質(zhì)限度[5，42]。相對(duì)于原料而言，其他制劑如干混懸劑[16]、膠囊劑、分散片劑[17]等劑型中通常含有高分子輔料，若采用分子排阻G-10法，可能會(huì)出現(xiàn)聚合物雜質(zhì)和高分子輔料共出峰的情況，在對(duì)該類制劑進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)排除輔料的干擾。

復(fù)方制劑的聚合物雜質(zhì)檢測(cè)則更為復(fù)雜，β-內(nèi)酰胺類抗生素復(fù)方制劑多為含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的制劑，不僅增強(qiáng)了抗菌活性、擴(kuò)大了抗菌譜，還能從一定程度上解決細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題[43]。但研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)此類復(fù)方制劑進(jìn)行雜質(zhì)譜研究時(shí)，雜質(zhì)生成速度較單方制劑更快，且可能有僅在復(fù)方制劑中檢出的新未知雜質(zhì)產(chǎn)生[44]。盡管實(shí)驗(yàn)表明，目前并未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑自身聚合雜質(zhì)及β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑之間發(fā)生聚合的聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生[45-46]，但β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的存在是否會(huì)影響β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生聚合物雜質(zhì)的含量、聚合程度和雜質(zhì)保留行為，以及通過(guò)何種途徑促使β-內(nèi)酰胺類抗生素的降解仍有待于進(jìn)一步的研究。

3 頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究

3.1 質(zhì)譜法(MS)

MS技術(shù)的應(yīng)用，讓研究者們對(duì)聚合物雜質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)有了更深入的認(rèn)識(shí)。李曼琳等[47]采用LC-MS技術(shù)，通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF/MS)和三重四級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)分別測(cè)定頭孢妥侖匹酯中主要有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確質(zhì)量和子離子特征，最終共鑒定出10個(gè)主要有關(guān)物質(zhì)，其中包括頭孢妥侖匹酯二聚體和開環(huán)二聚體雜質(zhì)，與其他有關(guān)物質(zhì)相比，該類雜質(zhì)對(duì)反應(yīng)溫度和時(shí)間更為敏感。蔣惠源等[48]通過(guò)超高效親水性液相色譜-電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)頭孢泊肟酯中的一個(gè)二聚體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測(cè)，經(jīng)裂解途徑和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)驗(yàn)證推斷，該二聚體為兩分子的頭孢泊肟酸經(jīng)L型聚合反應(yīng)形成。侯玉榮等[49]建立了高效液相色譜串聯(lián)離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLCUV-IT-TOF)的方法對(duì)頭孢噻肟鈉進(jìn)行了雜質(zhì)譜研究。對(duì)于無(wú)對(duì)照品的未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定(如聚合物雜質(zhì)等)，通過(guò)采用已知結(jié)構(gòu)化合物如頭孢噻肟為模型，分析已知結(jié)構(gòu)物質(zhì)與未知雜質(zhì)多級(jí)質(zhì)譜行為的異同性，從而推定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。其中，樣品中檢出6個(gè)二聚體雜質(zhì)，為采用RP-HPLC控制該品種的聚合物雜質(zhì)及其結(jié)構(gòu)研究提供了思路。但是，聚合物雜質(zhì)存在多種聚合位點(diǎn)和方式，較為復(fù)雜，且在聚合過(guò)程中易產(chǎn)生多種手性異構(gòu)體，而通過(guò)質(zhì)譜圖、推斷質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析只能初步推測(cè)聚合物雜質(zhì)的平面結(jié)構(gòu)，聚合位點(diǎn)以及立體化學(xué)結(jié)構(gòu)還有待通過(guò)其他波譜學(xué)方法進(jìn)一步確證。

3.2 核磁共振技術(shù)(NMR)

NMR法是表征化合物結(jié)構(gòu)的重要手段，也是揭示聚合物雜質(zhì)反應(yīng)機(jī)理的工具之一。Xia等[50]在不同濃度、不同pH值和不同溫度下對(duì)比阿培南進(jìn)行了強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)。采用RP-HPLC和LC-MS/MS法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，最后通過(guò)反相制備HPLC得到了一種二聚體雜質(zhì)，結(jié)合NMR法對(duì)其進(jìn)行了表征，并提出了比阿培南可能的降解途徑。王丹丹等[51]通過(guò)制備液相法成功制備分離出了鹽酸頭孢他美酯原料藥中含量較大、分離度相對(duì)較高的3個(gè)雜質(zhì)，并采用NMR法確證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中包括兩個(gè)合成副產(chǎn)物和一個(gè)高分子二聚體雜質(zhì)。但由于聚合物雜質(zhì)的不穩(wěn)定及結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，目前幾乎尚未系統(tǒng)性地對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。然而，聚合物雜質(zhì)對(duì)照品的獲得和結(jié)構(gòu)確證對(duì)提高頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)控制至關(guān)重要，因此也是接下來(lái)的聚合物雜質(zhì)研究工作中亟須解決的問(wèn)題之一。

3.3 二維高效液相色譜法(2D-HPLC)

2D-HPLC法能將兩根互相獨(dú)立的色譜柱進(jìn)行串聯(lián)，使得樣品組分可以在兩個(gè)不同的分離系統(tǒng)下進(jìn)行分離。運(yùn)用2D-HPLC技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)SEC法與RPHPLC法在線分析的無(wú)縫銜接[52]，也為聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中因聚合物雜質(zhì)峰定位困難而帶來(lái)的繁重工作量提供了解決方案。譚洪泉等[53]建立高效凝膠色譜法(HPGPC)法并聯(lián)合RP-HPLC法，利用兩個(gè)色譜系統(tǒng)的互補(bǔ)性對(duì)樣品在高效凝膠色譜系統(tǒng)中的未知來(lái)源雜質(zhì)(包括聚合物雜質(zhì))進(jìn)行了歸屬，解決了聚合物雜質(zhì)在RP-HPLC中保留時(shí)間較長(zhǎng)，可能出現(xiàn)漏檢等問(wèn)題。秦峰等[54]運(yùn)用在線二維凝膠色譜反相液相色譜法分別對(duì)Sephadex G10和TSK高效凝膠系統(tǒng)中主峰前的洗脫餾分進(jìn)行了切換分析，成功將凝膠色譜法與指針性雜質(zhì)的定位結(jié)合起來(lái)，并聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)致敏性聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步推斷。阮昊等[55]采用二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)注射用阿洛西林鈉的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行定位分析和結(jié)構(gòu)鑒定，在反相高效液相色譜上定位出了4種聚合物雜質(zhì)，并分別推導(dǎo)出其可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3.4 LC/MS-柱切換技術(shù)

在分離分析頭孢菌素這類抗生素時(shí)，配制流動(dòng)相通常需要用到磷酸鹽等非揮發(fā)性鹽類成分。由于非揮發(fā)性緩沖鹽進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器后會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低，分離效果變差，污染質(zhì)譜系統(tǒng)[56]。因此，在利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)目標(biāo)聚合物雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定時(shí)不適合直接利用LC-MS法進(jìn)樣分析，操作煩瑣。采用柱切換LC-MS聯(lián)用技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在切換色譜系統(tǒng)前對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行在線脫鹽，避免在不同色譜系統(tǒng)中因更換流動(dòng)相而導(dǎo)致目標(biāo)雜質(zhì)保留時(shí)間發(fā)生變化而無(wú)法準(zhǔn)確定位，既節(jié)省了時(shí)間也能夠保證雜質(zhì)定性的準(zhǔn)確性。由于《中國(guó)藥典》2015年版中注射用頭孢美唑鈉有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的色譜系統(tǒng)中含有不揮發(fā)性的離子對(duì)試劑四丁基氫氧化銨，無(wú)法直接采用LC-MS法進(jìn)樣分析，李進(jìn)等[57]通過(guò)柱切換-LC/MSn技術(shù)對(duì)該制劑中的目標(biāo)雜質(zhì)進(jìn)行了富集、脫鹽預(yù)處理及質(zhì)譜分析，更為快速、簡(jiǎn)便地推定了其主要雜質(zhì)峰結(jié)構(gòu)。胡衛(wèi)國(guó)等[58]采用改良親水凝膠色譜柱(Cef-SEC)分析了頭孢硫脲中的聚合物雜質(zhì)，并運(yùn)用在線脫鹽-高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(2D-LC-IT-TOF/MS)對(duì)聚合物雜質(zhì)進(jìn)行了鑒定。柱切換系統(tǒng)中1D色譜條件和2D色譜條件通過(guò)一組共用的餾分收集環(huán)進(jìn)行連接，通過(guò)控制程序進(jìn)行時(shí)間切換來(lái)捕集目標(biāo)化合物，可在不改變流動(dòng)相條件的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了雜質(zhì)的切換分離。在鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，又實(shí)現(xiàn)了對(duì)1D-HPLC色譜圖中聚合物雜質(zhì)的定位。此外，近年來(lái)，隨著聚合物雜質(zhì)控制的迫切需要，李進(jìn)等還通過(guò)柱切換-LC/MSn技術(shù)分別對(duì)阿莫西林克拉維酸鉀[59]、哌拉西林他唑巴坦鈉[46]、頭孢拉定[25]、頭孢噻肟鈉[40]、頭孢他啶[41]、頭孢地尼[60]、頭孢克肟[61]和頭孢鹽酸甲肟[62]等多種β-內(nèi)酰胺類抗生素原料及制劑中的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行了研究，極大地推動(dòng)了聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究，為聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 計(jì)算化學(xué)在探尋聚合規(guī)律中的應(yīng)用

聚合物雜質(zhì)存在多種聚合方式和位點(diǎn)，之前的研究中，研究者認(rèn)為β-內(nèi)酰胺類抗生素主要存在兩種聚合方式，分別為發(fā)生在母核的N型聚合反應(yīng)和發(fā)生在側(cè)鏈的L型聚合反應(yīng)。但兩種聚合方式的得出僅是根據(jù)多年實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)、質(zhì)譜等手段初步推斷，并未得到系統(tǒng)確證。因此，研究并確證不同種類β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物雜質(zhì)的聚合方式仍是質(zhì)控路上的關(guān)鍵及難點(diǎn)之一。只有在明確聚合物雜質(zhì)的聚合位點(diǎn)規(guī)律之后，才能真正做到對(duì)不同聚合程度的雜質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)指針性控制。

日前，隨著計(jì)算化學(xué)的飛速發(fā)展，使得從理論體系的角度對(duì)復(fù)雜化合物的反應(yīng)趨勢(shì)進(jìn)行一定水平上的指導(dǎo)及預(yù)測(cè)成為了可能。伍啟章[63]首次利用計(jì)算化學(xué)，通過(guò)量子化學(xué)軟件模擬了幾種代表性青霉素類抗生素的不同聚合位點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)途徑，比較了它們反應(yīng)前后的能量變化和反應(yīng)限速階段的活化能，推測(cè)聚合反應(yīng)發(fā)生的難易程度，從理論上解釋優(yōu)勢(shì)聚合產(chǎn)物的存在。然后分別選取部分廠家的原料藥和注射粉針劑進(jìn)行檢測(cè)，在柱切換體系下，采用液質(zhì)聯(lián)用方法分析并驗(yàn)證了各種二聚體聚合位點(diǎn)的傾向性。研究表明，青霉素類抗生素根據(jù)6位側(cè)鏈上有無(wú)自由氨基，共有4種可能的結(jié)合位點(diǎn)，分別為β-內(nèi)酰胺環(huán)之間的聚合，β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)與2位羧基側(cè)鏈的結(jié)合(N型聚合反應(yīng))；β-內(nèi)酰胺環(huán)與6位側(cè)鏈活潑氨基的聚合，6位側(cè)鏈活潑氨基與2位羧基側(cè)鏈的結(jié)合(L型聚合反應(yīng))。以上4種反應(yīng)途徑理論上均可以發(fā)生，但因反應(yīng)的活化能不同，反應(yīng)難易程度不盡相同，最終形成或檢出的優(yōu)勢(shì)聚合產(chǎn)物也可能只有一種。

頭孢菌素類抗生素β-內(nèi)酰胺六元環(huán)3位多有側(cè)鏈存在，聚合物雜質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)規(guī)律研究較青霉素類抗生素更為復(fù)雜。在對(duì)該類抗生素進(jìn)行聚合位點(diǎn)分析時(shí)，可按照頭孢菌素類抗生素3位有無(wú)側(cè)鏈及氨基側(cè)鏈，7位側(cè)鏈有無(wú)氨基結(jié)構(gòu)或氨噻肟結(jié)構(gòu)將頭孢菌素類抗生素分為6大類[64]。因其7位側(cè)鏈可能存在氨噻肟中活潑氨基基團(tuán)或游離氨基基團(tuán)、3位可能具有氨基側(cè)鏈等聚合反應(yīng)進(jìn)攻位點(diǎn)，因此可能的聚合位點(diǎn)也更為多樣。對(duì)該類抗生素聚合反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行深度探索的思路仍是需要通過(guò)計(jì)算化學(xué)軟件從化學(xué)反應(yīng)原理上進(jìn)行理論推斷后通過(guò)柱切換-LC/MSn、NMR等技術(shù)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，最終確定聚合規(guī)律。

5 思考及展望

β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)穩(wěn)定性極差，出峰情況復(fù)雜，兼具多種手性異構(gòu)體和開環(huán)類副產(chǎn)物，因此，其雜質(zhì)對(duì)照品的結(jié)構(gòu)確定和制備仍是目前的一大挑戰(zhàn)。針對(duì)此問(wèn)題，首先要對(duì)聚合反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行深度探索，通過(guò)量子化學(xué)軟件從原理上總結(jié)并分析各類β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)的聚合位點(diǎn)和取代機(jī)理，找尋聚合物雜質(zhì)的聚合規(guī)律。通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)獲知雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)及雜質(zhì)來(lái)源后采用反合成技術(shù)和富集雜質(zhì)后采用制備液相技術(shù)是目前常見(jiàn)的雜質(zhì)制備方法。但考慮到合成成本、制備效率等問(wèn)題，著眼于強(qiáng)降解樣品溶液對(duì)聚合物雜質(zhì)進(jìn)行富集，通過(guò)制備型液相色譜分離純化目標(biāo)雜質(zhì)，并采用核磁共振技術(shù)確證結(jié)構(gòu)的方式[65]，將具有更大的現(xiàn)實(shí)意義。

實(shí)踐證明，RP-HPLC法應(yīng)是β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)質(zhì)控中更為理想的分析方法。2D-HPLC及柱切換LC-MS技術(shù)已經(jīng)解決了目前所存在的聚合物雜質(zhì)定位困難的問(wèn)題，但液相方法的開發(fā)與優(yōu)化仍是需要進(jìn)一步探究的重點(diǎn)，以QbD理念中的DOE手段為突破口，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理篩選最優(yōu)化方法將是今后復(fù)雜化合物分析方法建立的一大趨勢(shì)。其次，只有在了解最有利于聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生的具體條件，如確切的放置時(shí)間、溫度范圍、溶劑pH等后，才能更加明確頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺類抗生素的最佳生產(chǎn)環(huán)境、貯存條件和使用途徑，解決聚合物雜質(zhì)制備過(guò)程中雜質(zhì)不穩(wěn)定、濃度過(guò)低等難題，因此，也是亟須解決的一大問(wèn)題。

最后，大量文獻(xiàn)表明，歸屬于青霉素類抗生素的氨芐西林、阿莫西林，因其6位側(cè)鏈上存在自由氨基，更易成為進(jìn)攻位點(diǎn)與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生聚合[59，66]。研究者[63]也通過(guò)計(jì)算化學(xué)軟件模擬后發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的聚合反應(yīng)過(guò)程從熱力學(xué)角度來(lái)說(shuō)屬于放熱反應(yīng)，相對(duì)于其他青霉素類抗生素而言可在相同降解條件下產(chǎn)生更多數(shù)量的聚合物雜質(zhì)，有利于聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)等研究。目前，國(guó)內(nèi)外藥典均已收載有關(guān)這類藥物的聚合物雜質(zhì)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。而對(duì)于頭孢菌素類抗生素，研究表明，其C7位的R1側(cè)鏈與青霉素的C6位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相同或相似是導(dǎo)致交叉過(guò)敏反應(yīng)的關(guān)鍵原因[67]。同理，頭孢氨芐7位側(cè)鏈上也有游離氨基的存在，同時(shí)β-內(nèi)酰胺環(huán)3位無(wú)活性側(cè)鏈干擾，推測(cè)該品種與氨芐西林相似易發(fā)生聚合反應(yīng)。但值得注意的是，頭孢氨芐聚合物雜質(zhì)的有關(guān)研究及其在實(shí)際藥物中是否威脅著公眾的用藥安全卻鮮有報(bào)道。因此，后續(xù)研究將以頭孢氨芐等7位含有游離氨基的頭孢菌素類抗生素為切入點(diǎn)，深入探討該類聚合物雜質(zhì)的確切結(jié)構(gòu)和聚合規(guī)律。在今后的聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，總結(jié)并歸納具有不同結(jié)構(gòu)特征的頭孢菌素類抗生素生成聚合物雜質(zhì)的難易程度，將有利于形成控制指定品種聚合物雜質(zhì)的策略，在保證公眾用藥安全的同時(shí)，提高聚合物雜質(zhì)控制的效率，節(jié)約質(zhì)控成本，將具有重大意義。同時(shí)，也可為將來(lái)的聚合物雜質(zhì)致敏性研究奠定基礎(chǔ)。