謝柱添，余冰瑩，楊秋霞，羅枝偉，潘文龍，陳 泳**

(1.廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省工業(yè)助劑逆向工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070；2.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 511400；3.中國科學(xué)院華南植物園公共實驗室，廣東 廣州 510650)

云木香是常見的中藥材之一，又名廣木香，具有多種生物活性，常用于行氣止痛、健脾消食[1-3]。云木香的化學(xué)成分較為復(fù)雜，其中的萜類物質(zhì)含量最高，主要集中在揮發(fā)油部位[4-6]。目前,針對揮發(fā)油的提取手段主要有水蒸氣蒸餾法[7-8]、溶劑提取法(索氏提取法)[9-10]、超臨界CO2萃取法[11-12]、微波萃取法[13-14]和固相微萃取法[15-16]等。針對不同種類木香存在售賣混亂的現(xiàn)象，需加強對木香各方面的研究，建立一種對木香的品質(zhì)進行準確鑒定分析的標準。

2020版《中國藥典》中采用高效液相色譜法對云木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯進行含量測定，而GC-MS技術(shù)更適用于揮發(fā)油成分的檢測。目前有許多科研人員將GC-MS技術(shù)應(yīng)用在揮發(fā)油成分較豐富的中藥材的質(zhì)量控制上，為其在云木香質(zhì)量控制的應(yīng)用起一定的鋪墊和推動作用。本文采用GC-MS技術(shù)對通過水蒸氣蒸餾法和索氏提取法提取的不同批次云木香揮發(fā)油，以及經(jīng)過硅烷化處理的云木香揮發(fā)油進行成分的分析和對比。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B/5977B型GC-MS聯(lián)用儀(美國Aglient公司，配有電子轟擊離子源(EI)和GCMSD數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

云木香(批次：181001421(A)和20180517(B)，購于廣東省廣州市)；二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯(AR)；石油醚(AR，30～60 ℃)；吡啶(AR，w≥99.5%，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司)；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(96%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三甲基氯硅烷(w>98.0%，上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 樣品處理

將云木香用烘箱 40 ℃ 烘烤 1 h 后，粉碎過三號篩(粒徑為355±13 μm )。

水蒸氣蒸餾：準確稱取20.0000 g粉碎后的樣品，加 200 mL 狜純化水常溫浸泡 30 min，提取揮發(fā)油。用氯仿進行分配除去水分，收集氯仿層，吹干氯仿層得純揮發(fā)油HA、HB。移取 1.0 μL 揮發(fā)油，用 1 mL 二氯甲烷溶解配制，待進樣。

分段索氏提?。簻蚀_稱取 1.0000 g 粉碎后的樣品，采用索氏提取裝置，石油醚 80 ℃ 回流提取 2 h，濃縮得石油醚提取產(chǎn)物SPB。再使用二氯甲烷進行 55 ℃ 回流提取 2 h，濃縮得二氯甲烷提取產(chǎn)物SDB。再使用乙酸乙酯 105 ℃ 回流提取 2 h，濃縮得乙酸乙酯提取產(chǎn)物SEB。進樣前移取 1.0 μL 各溶劑提取產(chǎn)物，用 1 mL 二氯甲烷溶解配制，待進樣。

硅烷化衍生：移取 20 μL 水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油于 5 mL 的具塞離心管中，加入 300 μL 的吡啶和 200 μL 的硅烷化試劑[V(MSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)]，超聲 1 min，渦旋 1 min，85 ℃ 下衍生化 1 h，得揮發(fā)油硅烷化產(chǎn)物。進樣前移取 15.0 μL 硅烷化產(chǎn)物，用 1 mL 二氯甲烷溶解配制，待進樣。

1.3 實驗條件

GC：HP-5MS (30 m×φ250 μm,0.25 μm)彈性石英毛細管柱；升溫程序：60 ℃ 保持 3 min，以 25 ℃/min 升溫到 145 ℃ 保持 3 min 后，以 0.2 ℃/min 升溫到 147 ℃ 保持 2 min 后，以 0.8 ℃/min 升溫到 160 ℃ 保持 1 min 后，以 35 ℃/min 升溫到 300 ℃ 保持 3 min；汽化室溫度 250 ℃；載氣為高純氦氣(He)；總流量 104.2 mL/min；進樣量為 1.0 μL；脈沖不分流進樣，進樣脈沖壓力 172.38 kPa(25 psi)，時間 0.5 min。

MS：EI源；離子源溫度為 230 ℃；四級桿溫度為 150 ℃；電子能量為 70 eV；質(zhì)譜與氣相色譜連接口溫度 300 ℃；溶劑延遲時間 3 min；掃面質(zhì)量范圍為50.00～600.00 u。

1.4 GC-MS測定

自動進樣，用GC-MS技術(shù)分析，得到全成分總離子流圖(TIC)，將采得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索得到的數(shù)據(jù)進行比較，對比標準圖譜鑒定每個色譜峰的化學(xué)成分，用面積歸一法計算各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 云木香揮發(fā)油提取率的比較

由表1可知，HB比HA的含量少，推測B[云木香批次181001421(A)，20180517(B)]在炮制過程中受到較高溫度的烘烤，損失了部分的揮發(fā)性物質(zhì)。但作為中藥材，炮制能使藥效成分更容易被利用，所以經(jīng)過炮制的云木香有效活性成分的相對含量應(yīng)比未炮制的高。索氏提取法提油率大于水蒸氣蒸餾法，且隨著溶劑極性的升高，提油率降低，可見索氏提取法能提取極性較小的成分。

表1 云木香揮發(fā)油的提取率

2.2 不同批次的云木香揮發(fā)油成分檢測結(jié)果的比較

HA、HB的GC-MS檢測結(jié)果見圖1。

圖1 兩批次云木香揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

圖2 云木香B不同溶劑提取物GC-MS總離子流圖

從中分別鑒定出63、59個化合物，其峰面積之和占總峰面積的99.06%、99.14%。由表2可知，HA中的主要成分有去氫木香內(nèi)酯(30.05%)、柏木烯醇(11.61%)、木香醇(11.43%)和二氫去氫木香內(nèi)酯(7.24%)等，萜類物質(zhì)占比為91.14%。HB的主要代表成分有去氫木香內(nèi)酯(30.66%)、柏木烯醇(11.85%)、木香醇(10.67%)和(Z,Z,Z)-1,8,11,14-十七烷四烯(8.77%)等，萜類物質(zhì)占比為85.55%。兩批次云木香揮發(fā)油中有38種化合物相同。兩批次含量最多的10種化合物中有9種相同，其中二氫去氫木香內(nèi)酯的含量差異較大，其他化合物的含量區(qū)別不顯著?？傮w來說，HA和HB的化學(xué)成分相似，所以推斷云木香質(zhì)量上差異有可能是主要成分的含量差異造成的。因此，可將去氫木香內(nèi)酯、柏木烯醇、木香醇、(Z,Z,Z)-1,8,11,14-十七烷四烯和二氫去氫木香內(nèi)酯作為檢測的指標化合物對云木香進行質(zhì)量評估。

2.3 不同提取方法所得云木香揮發(fā)油成分檢測結(jié)果的比較

索氏提取法得到的提取物的GC-MS總離子流圖見圖2，化學(xué)成分和含量分析見表2。

表2 云木香揮發(fā)油化學(xué)成分和相對質(zhì)量分數(shù)

表2(續(xù))

表2(續(xù))

從SPB、SDB和SEB中分別鑒定出35、21個和6個化合物，已檢出化合物峰面積占比為89.57%、90.22%和87.36%。

隨著提取溶劑極性的增加，提取率、分離組分數(shù)和鑒定成分數(shù)都降低，而主要成分的占比則升高，可見云木香揮發(fā)油中大部分物質(zhì)極性較低，主要成分極性偏高。從SPB、SDB和SEB中共鑒定出37種化合物，種類以萜醇和萜類內(nèi)酯居多，而HB中化合物種類以萜醇居多。水蒸氣蒸餾法提取化合物數(shù)量和種類較多。所以對質(zhì)量控制而言，云木香揮發(fā)油成分的提取適宜采用常規(guī)的水蒸氣蒸餾法。

2.4 云木香揮發(fā)油直接進樣與硅烷化處理后進樣檢測結(jié)果的比較

為研究云木香揮發(fā)油中因難汽化而不易被GC-MS檢測到的化學(xué)成分，本文對揮發(fā)油進行硅烷化試劑衍生化處理，結(jié)果見圖3。

可明顯看出，硅烷化前后峰形出現(xiàn)的變化，硅烷化后的揮發(fā)油較處理前的出峰豐度高，出峰數(shù)目多。

對有偏移或增加的峰進行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)有26個新出現(xiàn)的峰，通過還原化合物結(jié)構(gòu)式，得出23種未硅烷化前測不到的化合物，其中三甲基甲硅烷基酯-9,12-十八碳二烯酸的相對含量較高，可擬定為檢測指標化合物。由于采用的硅烷化試劑是針對羥基和羧基等基團上的活潑氫進行取代，所以衍生化處理后，測得的化合物主要為萜醇、羧酸和萜烯酸類物質(zhì)，且硅烷化后，出現(xiàn)了甾類、羧酸和萜烯酸類物質(zhì)等處理前檢測不出的化合物，證明硅烷化處理能為檢測指標化合物的增加提供可行性。

3 結(jié)論

本文利用GC-MS技術(shù)對提取的云木香揮發(fā)油進行分析研究。初步判斷GC-MS技術(shù)可為中藥的鑒定及質(zhì)量評價提供更準確的依據(jù)?？梢罁?jù)GC-MS技術(shù)建立不同品質(zhì)云木香的鑒定指標，完善評價標準，有利于規(guī)范市場銷售。進一步的工作是針對初步選取的指標化合物進行生物活性的研究，并根據(jù)已選取的提取方法和指標化合物，建立一套完整的云木香GC-MS檢測方法。