劉文倩，趙順英，葉維貞，姜鳴鈺，陳文濤，陳青芳，溫少紅，董雯，劉向榮

我國面臨著嚴重的卒中負擔，卒中在所有死亡原因中位列第三，其中缺血性卒中占所有卒中的64.9%[1]。及時有效的治療能減少缺血性卒中的復(fù)發(fā)、致殘及死亡不良結(jié)局[2-3]。毛柳苷也稱紅景天苷，是我國傳統(tǒng)中藥紅景天的提取物，也是其主要的藥效成分。紅景天具有益氣活血的功效，可用于卒中后偏癱的治療。近年來的研究及本課題組的前期研究均發(fā)現(xiàn)，毛柳苷在缺血性腦損傷后可能通過抑制氧化應(yīng)激、反應(yīng)性膠質(zhì)增生、調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4-5]，但其作用詳細的分子機制尚不十分清楚。

白介素4誘導(dǎo)蛋白1（interleukin-4 induced protein 1，IL4I1）是在IL-4的誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種氨基酸氧化酶，可將苯丙氨酸氧化為苯丙酮酸，該反應(yīng)同時釋放氨和過氧化氫[6]。IL4I1作為免疫調(diào)節(jié)蛋白參與機體免疫應(yīng)答的過程[7]。針對多發(fā)性硬化的研究發(fā)現(xiàn)，IL4I1可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化并促進神經(jīng)髓鞘再生[8]。由此推測毛柳苷可能通過影響IL4I1的表達，進而調(diào)節(jié)腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細胞的激活和炎癥表型變化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

1 對象與方法

1.1 實驗對象及藥物 ①實驗動物：選取8～12周C57BL/6J雄性小鼠38只，體質(zhì)量20.0±0.5 g（北京華阜康生物科技控股有限公司）。本實驗遵照動物倫理相關(guān)要求進行，實驗小鼠飼養(yǎng)于22～26 ℃，相對濕度50%～60%，12 h循環(huán)照明的環(huán)境中，自由攝食水。②小膠質(zhì)細胞：BV2小鼠小膠質(zhì)細胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心）復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（HyClone，美國）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（HyClone，美國）中。③實驗藥物：毛柳苷粉末（Sigma，美國）按1 mg/mL溶解于生理鹽水后備用。

1.2 模型制作與藥物注射 小鼠隨機分為3組：假手術(shù)組4只、腦缺血再灌注后注射毛柳苷組（簡稱毛柳苷組）17只、腦缺血再灌注后注射生理鹽水組（簡稱生理鹽水組）17只。

模型制作：小鼠經(jīng)異氟烷麻醉，仰臥位，分離頸總動脈起始段，通過頸內(nèi)動脈插入線栓至大腦中動脈，60 min后拔栓以恢復(fù)血流實現(xiàn)再灌注，逐層縫合皮膚。手術(shù)期間使用保溫墊，監(jiān)測小鼠肛溫，保持在37.0±0.5 ℃。激光散斑儀（瑞沃德，中國）檢測缺血前基線、缺血后60 min的腦血流，缺血后60 min腦血流低于基線水平的30%為模型成功。腦缺血再灌注后10 min，毛柳苷組與生理鹽水組小鼠分別經(jīng)尾靜脈按照10 mg/kg注射毛柳苷與生理鹽水，每天1次，持續(xù)28 d。

1.3 血清IL4I1濃度檢測

1.3.1 血清制備 采集假手術(shù)組及缺血再灌注（毛柳苷組和生理鹽水組）后48 h、7 d、28 d血清，其中假手術(shù)組4只，缺血再灌注28 d時每組各5只，其余時間點每組各4只。使用10%水合氯醛麻醉小鼠，通過摘眼球法獲取全血，靜置2 h后，在常溫下以4000 r/min離心15 min，取上清液即為血清。

1.3.2 ELISA法檢測血清IL4I1濃度 使用ELISA試劑盒（MyBioSource，美國）檢測小鼠血清中IL4I1的濃度。設(shè)置2個復(fù)孔，每孔加入40 μL血清、10 μL IL4I1抗體與50 μL辣根過氧化物酶標記生物素，37 ℃下避光反應(yīng)60 min，清洗96孔板5次，先后加入底物溶液A與B各50 μL，37 ℃下避光反應(yīng)10 min，加入50 μL終止液，10 min內(nèi)在450 nm檢測光密度值，繪制標準曲線，計算各樣本的IL4I1濃度。

1.4 腦梗死體積測定 取毛柳苷組與生理鹽水組小鼠各4只，缺血再灌注后7 d取腦并進行冰凍切片6層，使用神經(jīng)元特異核蛋白抗體（neuronal nuclei，NeuN）抗體，（Millipore，美國）進行免疫熒光染色標記6個層面的神經(jīng)元，以確定梗死體積。通過Vectra Polaris全自動成像系統(tǒng)（Perkin-Elmer，美國）拍攝熒光圖片。使用Image J軟件統(tǒng)計不同層面的腦梗死體積，梗死體積=各層健側(cè)腦組織體積之和-各層損傷側(cè)正常腦組織體積之和。

1.5 小膠質(zhì)細胞三維形態(tài)及突起長度和數(shù)量分析 取生理鹽水組與毛柳苷組小鼠各4只，缺血再灌注后7 d腦組織冰凍切片，進行離子化鈣結(jié)合適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）熒光染色標記損傷區(qū)周圍小膠質(zhì)細胞。使用LSM710激光共聚焦顯微鏡Z-stack拍攝小膠質(zhì)細胞3D圖像，并通過Imaris 9.0.1軟件Filament插件計算小膠質(zhì)細胞的突起長度、突起數(shù)量、突起的分叉點數(shù)量及突起的終末端點數(shù)量。

1.6 免疫組織熒光染色 取毛柳苷組與生理鹽水組缺血再灌注后7 d的腦組織冰凍切片，每組各4只小鼠，進行Iba1（和光純藥，日本）和CD16/32（BD Pharmingen，美國）及Iba1和CD206（R&D Systems，美國）免疫熒光共染，分別標記損傷區(qū)M1和M2型小膠質(zhì)細胞。使用LSM710激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）拍攝Iba1分別與CD16及CD206共定位圖像，Image J軟件統(tǒng)計M1、M2型小膠質(zhì)細胞的數(shù)量。

1.7 BV2小膠質(zhì)細胞不同表型IL4I1表達測定

1.7.1 BV2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)與表型誘導(dǎo) 設(shè)置空白對照組為M0型小膠質(zhì)細胞，使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（10 μg/mL，Sigma，美國）和INF-γ（10 μg/mL，Peprotech，美國）誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細胞極化為M1型小膠質(zhì)細胞；使用IL-4（10 μg/mL）（Peprotech，美國）和IL-13（10 μg/mL）（Peprotech，美國）誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細胞極化為M2型小膠質(zhì)細胞。

1.7.2 BV2小膠質(zhì)細胞蛋白提取 收集M0型及誘導(dǎo)48 h后的M1型和M2型細胞，每107細胞使用500 μL放射免疫沉淀法緩沖液（radio immunoprecipitation assay buffer，RIPA）蛋白裂解液（索萊寶，中國）提取小膠質(zhì)細胞蛋白，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清即為細胞蛋白裂解液。

1.7.3 蛋白印跡測定BV2小膠質(zhì)細胞IL4I1表達使用10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行電泳（每孔40 μg蛋白），后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene，PVDF）。使用含0.1%吐溫20和5%胎牛血清白蛋白的Tris緩沖液室溫封閉膜60 min，兔來源抗鼠IL4I1抗體（博奧森，中國）、鼠來源抗鼠β-Actin抗體（景杰生物科技有限公司，中國）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶耦聯(lián)抗兔、抗鼠二抗（CST，美國）室溫孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Abcam，英國）通過G：BOX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene，英國）檢測蛋白條帶，并使用Image J分析圖像計算IL4I1相對表達量。

1.8 統(tǒng)計方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，用表示，單時間點兩組比較采用獨立t檢驗；單時間點多組比較采用單因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義的情況下進行Tukey檢驗兩兩比較；多時間點多組比較采用雙因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義的情況下進行Bonferroni法兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血再灌注后血清IL4I1的表達 生理鹽水組腦缺血再灌注后48 h、7 d、28 d與假手術(shù)組相比血清中IL4I1濃度整體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0235）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，生理鹽水組腦缺血再灌注后48 h血清中IL4I1濃度降低（P=0.0302）；生理鹽水組腦缺血再灌注后7 d和28 d較48 h血清中IL4I1濃度有升高趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.8160，P=0.2874）。毛柳苷組與生理鹽水組腦缺血再灌注后48 h、7 d、28 d血清中IL4I1濃度整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001），兩兩比較發(fā)現(xiàn)兩組腦缺血再灌注后48 h血清中IL4I1濃度無差異（P=0.1581），毛柳苷組腦缺血再灌注后7 d和28 d血清中IL4I1濃度較生理鹽水組升高（P=0.0229，P=0.0076）。上述結(jié)果提示毛柳苷能促進小鼠缺血性腦損傷后早期及恢復(fù)期血清中IL4I1的表達（表1）。

表1 缺血再灌注后不同時間點不同組小鼠血清IL4I1濃度比較[單位：ng/L]

2.2 腦缺血再灌注后7 d腦梗死體積 NueN免疫熒光染色結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后7 d毛柳苷組小鼠腦梗死體積顯著低于生理鹽水組腦梗死體積（16.47±5.44 mm3vs.30.20±8.90 mm3，P=0.0389），表明毛柳苷可降低小鼠缺血再灌注后的腦梗死體積（圖1）。

圖1 生理鹽水組和毛柳苷組小鼠缺血再灌注后7 d腦梗死體積比較

2.3 腦缺血再灌注后7 d小膠質(zhì)細胞三維形態(tài)及突起變化 圖2顯示了腦缺血再灌注后7 d小鼠腦損傷區(qū)周圍小膠質(zhì)細胞的三維形態(tài)。與生理鹽水組相比，毛柳苷組小膠質(zhì)細胞的突起長度更長（110.60±24.93 μmvs. 95.64±27.65 μm，P=0.0040），單個小膠質(zhì)細胞突起數(shù)量更多（104.60±60.21個vs. 50.58±33.47個，P＜0.001），單個小膠質(zhì)細胞突起的分叉點數(shù)量（53.43±33.99個vs. 24.83±16.41個，P＜0.001）和終末端點數(shù)量（56.03±35.20個vs. 26.85±17.12個，P＜0.001）均增多。結(jié)果提示毛柳苷可促進小鼠缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細胞的進一步活化，促進突起伸長，增加突起分支（圖3）。

圖2 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細胞三維形態(tài)

圖3 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細胞突起長度與數(shù)量變化

2.4 腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài) Iba1+CD16/32+標記損傷區(qū)域周圍M1型小膠質(zhì)細胞，Iba1+CD206+標記M2型小膠質(zhì)細胞。統(tǒng)計皮層與紋狀體區(qū)域小膠質(zhì)細胞總數(shù)量、M1型與M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量，結(jié)果顯示毛柳苷組與生理鹽水組腦缺血再灌注后7 d皮層及紋狀體區(qū)域小膠質(zhì)細胞總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與生理鹽水組相比，毛柳苷組腦缺血再灌注后7 d梗死區(qū)域周圍皮層及紋狀體的M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少（皮層：P=0.0407，紋狀體：P=0.0032），M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著增多（皮層：P=0.0206，紋狀體：P=0.0075）（表2）。上述結(jié)果提示毛柳苷可促進小鼠缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細胞向M2型抗炎表型小膠質(zhì)細胞極化（圖4）。

圖4 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)

表2 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細胞不同表型數(shù)量[單位：個/mm2]

2.5 BV2小膠質(zhì)細胞不同極化表型IL4I1的表達水平 檢測BV2小膠細胞不同表型（M0、M1、M2）中IL4I1的表達情況。結(jié)果顯示，三種表型的小膠質(zhì)細胞IL4I1的表達差異整體具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.001）。與M0型相比，M1型與M2型BV2小膠質(zhì)細胞IL4I1表達均下降（P=0.0008，P=0.0155），M1型與M2型相比IL4I1表達下降（P=0.0406）。表明小膠質(zhì)細胞在激活狀態(tài)下降低IL4I1表達，M1型比M2型下降更多（圖5）。

圖5 BV2小膠質(zhì)細胞不同極化狀態(tài)下IL4I1表達情況

3 討論

急性缺血性卒中是致殘率較高的疾病，腦組織損傷后由于氧化應(yīng)激、興奮性毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡，造成感覺、運動神經(jīng)功能損傷[9-10]，因此腦缺血后進行神經(jīng)保護治療尤為重要。在本課題組前期的研究中，發(fā)現(xiàn)毛柳苷可通過調(diào)節(jié)小鼠腦缺血再灌注后14 d小膠質(zhì)細胞極化促進少突膠質(zhì)細胞分化及有髓神經(jīng)纖維髓鞘的再生，從而保護神經(jīng)功能，減少小鼠腦缺血后的認知功能障礙[4]。但前期實驗對毛柳苷是否影響缺血早期的腦組織損傷范圍并沒有進行分析，本實驗發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷早期，毛柳苷可減少腦梗死體積。

IL4I1參與機體抗感染防御，通過抑制T細胞增殖分化及限制B細胞增殖發(fā)揮免疫抑制作用，抑制機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，參與腫瘤免疫逃逸[11-12]。本實驗發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷發(fā)生后48 h，小鼠血清中IL4I1濃度下降，隨著損傷恢復(fù)到28 d又逐漸回升，而毛柳苷能夠減輕腦缺血后7 d IL4I1水平的下降程度，促進恢復(fù)期IL4I1濃度回升。缺血性腦損傷后血清中IL4I1濃度變化與損傷發(fā)生和恢復(fù)相關(guān)，因此IL4I1可能成為新的缺血性腦損傷診斷與預(yù)后的生物標志物。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細胞，小膠質(zhì)細胞在生理狀態(tài)下為靜息狀態(tài)（M0），在疾病狀態(tài)下可激活為促炎表型（M1）和抗炎表型（M2）。M1型細胞分泌IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子介導(dǎo)神經(jīng)炎癥[13]；M2型細胞則分泌精氨酸酶-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β等細胞因子抑制炎癥反應(yīng)[14]。損傷發(fā)生后小膠質(zhì)細胞由纖細分支狀變?yōu)槎毯裢黄鸲喾种?，便于快速地?yīng)答[15-17]。本實驗發(fā)現(xiàn)毛柳苷使缺血區(qū)周圍小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)出多突起分支狀，增加了小膠質(zhì)細胞的監(jiān)測范圍，促使其更快地感知損傷區(qū)域的炎癥并發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用。另外，毛柳苷促使腦組織損傷區(qū)周圍的小膠質(zhì)細胞由M1促炎表型向M2抗炎表型轉(zhuǎn)化。而M2型細胞的增多有助于損傷區(qū)域的炎癥修復(fù)，保護神經(jīng)細胞，提示毛柳苷可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化，抑制腦損傷區(qū)域的炎癥，保護神經(jīng)功能。本實驗中BV2小膠質(zhì)細胞IL4I1表達的研究發(fā)現(xiàn)，活化后小膠質(zhì)細胞不同表型中，IL4I1表達均降低，其中M1型較M2型細胞表達有更明顯的下降趨勢，提示IL4I1可能在小膠質(zhì)細胞激活和表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。結(jié)合本實驗缺血性腦損傷后毛柳苷促進腦組織IL4I1表達，且有研究發(fā)現(xiàn)IL4I1可調(diào)節(jié)巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞的極化[8，18]，提示毛柳苷可能通過促進缺血性腦損傷后免疫調(diào)節(jié)蛋白IL4I1的表達，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活與極化。不過，本實驗中未對IL4I1在缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細胞極化中的調(diào)節(jié)作用及機制進行研究，因此免疫調(diào)節(jié)蛋白IL4I1對小膠質(zhì)細胞極化的調(diào)節(jié)作用仍有待深入研究。

【點睛】本研究通過小鼠腦缺血再灌注模型和細胞培養(yǎng)，探索了毛柳苷在缺血性腦損傷后腦保護作用的分子機制，提示毛柳苷可能通過促進IL4I1表達調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞激活與極化，從而達到神經(jīng)保護的作用。